一种测定邻氯苯甘氨酸中潜在基因毒性杂质含量的分析方法技术

本发明专利技术公开了一种测定邻氯苯甘氨酸中潜在基因毒性杂质含量的色谱分析方法，包含以下步骤：取邻氯苯甘氨酸样品及邻氯苯甲醛对照品适量，用水配制成合适浓度的供试品溶液和对照品溶液，接着使用反相色谱柱，以高氯酸水溶液和乙腈混合溶液作为流动相A，乙腈作为流动相B，在紫外下进行梯度洗脱，最后按外标法以峰面积计算样品中邻氯苯甲醛的含量；该方法具有操作简单、快速准确、灵敏度高的优点。灵敏度高的优点。灵敏度高的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种测定邻氯苯甘氨酸中潜在基因毒性杂质含量的分析方法


[0001]本专利技术涉及一种测定邻氯苯甲醛含量的分析方法，尤其涉及一种测定邻氯苯甘氨酸中邻氯苯甲醛含量的分析方法。

技术介绍

[0002]邻氯苯甘氨酸(α
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Amino
‑2‑
chlorobenzeneacetic acid)是常用的化工原料，其CAS号为：88744
‑
36
‑
9，分子式为C8H8ClNO2，分子量为：185.61，化学结构为：
[0003][0004]邻氯苯甘氨酸作为一种常用的化工原料或医药中间体，广泛应用于化学原料药的制备与合成，可用来合成制备硫酸氢氯吡格雷。目前，常见的邻氯苯甘氨酸的合成工艺，主要采用以下路线：
[0005][0006]该路线中邻氯苯甲醛为合成邻氯苯甘氨酸的起始物料。而邻氯苯甲醛中芳香醛为基因毒性杂质警示结构，所以被认为是潜在基因毒性杂质。所谓“警示结构”，是指杂质中的特殊基团可能与遗传物质发生化学反应，诱导基因突变或者染色体断裂，因此具有潜在的致癌风险。为确保用药安全，对基因毒性杂质的含量需要进行严格的控制。邻氯苯甘氨酸可作为硫酸氢氯吡格雷的起始物料，以最严格的毒理关注阈值TTC＝1.5μg/day计算，根据硫酸氢氯吡格雷片最大日剂量300mg/day计算出邻氯苯甲醛的限度为5ppm，因此检测难度大；且邻氯苯甘氨酸中含有未知杂质与邻氯苯甲醛极性相近，干扰检测使之无法准确得到定性定量的检测结果，因此为有效控制邻氯苯甲醛的含量，需建立灵敏度高、分离度好的检测方法。

技术实现思路

[0007]专利技术目的：本专利技术的目的是提供一种灵敏度高、分离度好的邻氯苯甘氨酸中潜在基因毒性杂质邻氯苯甲醛的分析方法。
[0008]技术方案：本专利技术所述的一种测定邻氯苯甘氨酸中邻氯苯甲醛含量的分析方法，包含以下步骤：
[0009](1)溶液配制：取邻氯苯甘氨酸样品及邻氯苯甲醛对照品适量，用水配制成供试品溶液和对照品溶液；
[0010](2)液相方法条件：使用反相色谱柱，三氟乙酸水溶液或高氯酸水溶液有机溶剂的混合溶液作为流动相A，乙腈作为流动相B，在检测波长下进行梯度洗脱；
[0011](3)按外标法以峰面积计算样品中邻氯苯甲醛的含量。
[0012]优选的，步骤(2)中，所述反相色谱柱的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶或氰基键合硅胶。
[0013]优选的，步骤(2)中，所述流动相A中，三氟乙酸水溶液或高氯酸水溶液中有机溶剂的体积比为95:5～99:1，更优选的，流动相A为高氯酸水溶液与乙腈的混合溶液，二者体积比为98:2。
[0014]优选的，步骤(2)中，所述高氯酸水溶液体积浓度为0.02～0.1％，更优选的0.05％。
[0015]优选的，步骤(2)中，所述检测波长为230～260nm，进一步的，波长优选为250nm，邻氯苯甲醛有强吸收，且与其相邻的未知杂质吸收较弱。
[0016]优选的，步骤(2)中，所述梯度洗脱，色谱柱的柱温为25℃～35℃，流速为0.9～1.1ml/min；进一步的，色谱柱柱温优选为30℃，流速优选为1.0ml/min。
[0017]优选的，步骤(2)中，所述梯度如下：
[0018]洗脱时间(min)流动相A(％)流动相B(％)095～1005～0595～1005～01760～6240～383312～2588～753512～2588～753695～1005～04295～1005～0
[0019]所述梯度进一步优选为：
[0020][0021][0022]优选的，步骤(1)中，所述供试品浓度为3～7mg/ml；进一步的，优选为6mg/ml。
[0023]专利技术原理：邻氯苯甘氨酸及其杂质邻氯苯甲醛的结构如下式所示：
[0024][0025]由于邻氯苯甘氨酸和邻氯苯甲醛极性相差较大，可以选择氰基柱或十八烷基硅烷键合硅胶柱。在反相模式下，上述两色谱柱对强极性化合物的保留功能极强，可以高效分离邻氯苯甘氨酸和邻氯苯甲醛。在实验中发现邻氯苯甘氨酸极性需要使用高水相增强保留，氰基柱的键合官能团在高水相中易水解，不利于长期检测，十八烷基硅烷键合硅胶柱(ODS柱)有更好的疏水性，可耐高水相，尤其适用于本专利技术中需要在初始比例使用高水相使极性强的邻氯苯甘氨酸增强保留的情况。由于邻氯苯甘氨酸中还含有与邻氯苯甲醛极性相近的杂质化合物，通过干扰检测的杂质化合物的紫外吸收图谱可知在波长250nm下杂质化合物吸收较弱，而邻氯苯甲醛在250nm有强吸收，改变波长可有效的减少未知杂质干扰。此外，流动相A为三氟乙酸水溶液或高氯酸水溶液与有机溶剂的混合溶液，在使用高氯酸水溶液与乙腈的混合溶液可以在增强极性化合物邻氯苯甘氨酸保留的同时，还可以减少梯度运行时气泡的产生，并在高水相时保护色谱柱。在供试品可以溶解的范围内，使用较高供试品浓度增强响应，可以提高检测灵敏度。
[0026]有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有如下显著优点：(1)能够对邻氯苯甘氨酸中潜在基因杂质邻氯苯甲醛有效的分离并进行定量检测，目标杂质邻氯苯甲醛的定量限最低可达9ng/ml，检测限最低可达3ng/ml；(2)针对起始物料中潜在基因杂质进行控制从而大幅提高后续产品的安全性。
附图说明
[0027]图1为实施例1混合溶液的色谱图；
[0028]图2为实施例1对照品溶液的色谱图；
[0029]图3为实施例2混合溶液的色谱图；
[0030]图4为实施例3对照品溶液的色谱图；
[0031]图5为实施例4混合溶液的色谱图；
[0032]图6为对比例1供试品溶液的色谱图；
[0033]图7为对比例1定位溶液的色谱图；
[0034]图8为对比例2混合溶液的色谱图；
[0035]图9为对比例3混合溶液的色谱图。
具体实施方式
[0036]下面结合附图对本专利技术的技术方案作进一步说明。
[0037]实施例1
[0038]高效液相色谱仪：安捷伦1260；
[0039]色谱柱：ODS
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3 4.6
×
150mm，5μm；
[0040]流动相：A相：0.05％高氯酸水溶液：乙腈＝98:2(V/V)；
[0041]B相：乙腈；
[0042]检测波长：250nm；
[0043]流速：1.0ml/min；
[0044]柱温：30℃；
[0045]进样量：20μl；
[0046]稀释液：水；
[0047]洗脱梯度：
[0048]洗脱时间(min)流动相A(％)流动相B(％)0100051000176238332575352575361000421000
[0049]供试品溶液：取邻氯苯甘氨酸原料适量，加水溶解，配制成含邻氯苯甘氨酸6mg/ml的供试品溶液。
[0050]对照品溶液：取邻氯苯甲醛对照品适量，加水溶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种测定邻氯苯甘氨酸中邻氯苯甲醛含量的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)溶液配制：取邻氯苯甘氨酸样品及邻氯苯甲醛对照品适量，用水配制成供试品溶液和对照品溶液；(2)液相方法条件：使用反相色谱柱，三氟乙酸水溶液或高氯酸水溶液与有机溶剂的混合溶液作为流动相A，以乙腈作为流动相B，在检测波长下进行梯度洗脱；(3)按外标法以峰面积计算样品中邻氯苯甲醛的含量。2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤(2)中，流动相A中三氟乙酸水溶液或高氯酸水溶液与有机溶剂的体积比为95:5～99:1，所述有机溶剂为乙腈。3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤(2)中，所述反相色谱柱的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶或氰基键合硅胶。4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤(2)中，所述高氯酸水溶液体积浓度为0.02～0...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆剑，邓瑜，李安排，
申请(专利权)人：苏州正济医药研究有限公司，
类型：发明
国别省市：