一种利用表面等离子体共振技术检测沙门菌的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用表面等离子体共振技术检测沙门菌，包括如下步骤：(1)芯片的制备，所述的芯片为CM5芯片；(2)细菌培养，所述的细菌为肠炎沙门菌C50041；(3)细菌与抗体孵育，所述的抗体为沙门菌PagN(3B3)蛋白抗体；(4)游离抗体分离；(5)表面等离子体共振技术检测。相对于现有技术，本发明专利技术具有如下有益效果：本发明专利技术可以半定量检测样品中的沙门菌；将单克隆抗体作为检测靶标，本发明专利技术具有优良特异性；将表面等离子体共振技术应用于沙门菌检测，可以缩短检测时间；对再生条件进行了优化，可以确保检测的重复性。测的重复性。测的重复性。

【技术实现步骤摘要】
一种利用表面等离子体共振技术检测沙门菌的方法


[0001]本专利技术涉及一种利用表面等离子体共振技术检测沙门菌的方法。

技术介绍

[0002]沙门菌是一类人兽共患病食源菌。一直以来都被认为是引起食物微生物安全等公共卫生事件的最为常见的食源性致病微生物。尽管发病率不同，沙门菌病仍是危及全球的疾病。近年来研究表明，沙门菌每年造成将近9380万人感染和155000人死亡，沙门菌不仅严重影响了人们的健康，而且造成了严重的社会和经济问题。因此，沙门菌的快速灵敏检测在预防疾病的爆发流行，采取早期的干预措施和相应的治疗中具有重要意义。
[0003]传统的检测方法如平板培养法、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)、酶联免疫吸附分析(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)等虽然能够检测出沙门菌的种类及含量，但仍存在耗时、灵敏度低等缺点。如，平板培养法大约需要24～52h；ELISA法检测限约为106CFU/mL；PCR法虽然快速、灵敏，但可能出现假阳性且需要较长的处理时间。如何快速、精确、灵敏地从样品中检测出沙门菌是一个急需解决的问题。
[0004]随着表面等离子体共振技术的发展，由于其无需样品前处理、无标记、实时检测等优点，具有广阔的应用前景。目前，虽然该技术已经广泛地应用于包括细菌成分在内的多种分析物的直接检测，但尚未有基于表面等离子体共振技术消减抑制检测沙门菌的报道。

技术实现思路

[0005]针对以上问题，本申请提供了一种利用表面等离子体共振技术检测沙门菌的方法，具有较好的灵敏度和特异性。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术所采用的技术方案为：
[0007]一种利用表面等离子体共振技术检测沙门菌的方法，包括以下步骤：制备沙门菌检测芯片；培养待测细菌，将待测细菌与抗体孵育，游离抗体分离，通过梯度离心，将未与细菌结合的抗体分离出来；采用表面等离子体共振技术检测游离抗体的响应信号，进而计算得到待测沙门菌的含量；所述的抗体为沙门菌PagN蛋白单克隆抗体；
[0008]进一步的，所述沙门菌PagN蛋白单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区；
[0009]所述重链可变区包含V
H CDR1、V
H CDR2和V
H CDR3，所述轻链可变区包含V
L CDR1、V
L CDR2和V
L CDR3；
[0010]所述的V
H CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示；
[0011]所述的V
H CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示；
[0012]所述的V
H CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示；
[0013]所述的V
L CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示；
[0014]所述的V
L CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：5所示；
[0015]所述的V
L CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：6所示。
[0016]进一步的，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；轻链可变区氨基酸序列如
SEQ ID NO：8所示。
[0017]进一步的，重链氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示；轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
[0018]进一步的，编码所述单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示；编码所述单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示。
[0019]进一步的，编码所述单克隆抗体重链的核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示；编码所述单克隆抗体轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示。
[0020]进一步的，所述沙门菌检测芯片的制备方法包括：将Anti mouse IgG通过氨基偶联的方式固定到CM5芯片表面，随后用乙醇胺溶液对未结合的位点进行封闭；选择pH5.0醋酸钠溶液作为偶联缓冲液。
[0021]进一步的，所述培养待测细菌包括：将待测细菌落接种于LB液体培养基中培养过夜，随后菌液以1:100的比例接种于LB液体培养基，37℃，220r/min，培养3h；然后，用PBS在15mL离心管中洗涤3次，1500
×
g离心10min。
[0022]进一步的，所述将待测细菌与抗体孵育包括：取沙门菌PagN蛋白单克隆抗体与待测细菌菌液混合，室温孵育。
[0023]进一步的，所述梯度离心包括：将与抗体孵育后的菌液按照200、400、800、1200、1600
×
g分别离心2min。
[0024]一种利用表面等离子体共振技术检测沙门菌的方法，该方法包括以下步骤：
[0025](1)芯片的制备，所述的芯片为CM5芯片；
[0026](2)细菌培养，所述的细菌为肠炎沙门菌C50041；
[0027](3)细菌与抗体孵育，所述的抗体为沙门菌PagN蛋白单抗(3B3)；
[0028](4)游离抗体分离，通过梯度离心，可以将未与细菌结合的抗体分离出来；
[0029](5)表面等离子体共振技术检测。
[0030]所述的步骤(1)具体为：取5μL Anti mouse IgG加入162μL pH值为5.0的醋酸钠缓冲溶液(10nM sodium acetate)中，充分混匀。另取2个1.5mL的EP管，分别加入140μL乙醇胺溶液，100μLEDC和100μLNHS混合溶液。选择File
→
Open/New Wizard Template，打开向导对话框，选择Surface Preparation下的Immobilization，点击New，进入下一步，在Immobilization Setup向导窗口中，在Chip type下拉菜单中，选择CM5。本次实验会将配体固定在第2通道上，因此在Flow cell 2前的方框中打勾。Method选取Amine，Ligand中填入配体的名称：Anti mouse IgG，选择Specify contact time and flow rate模式进行偶联，Contact time：480s，Rate：5μL/min，点击Next，进入下一步。在System Preparations对话框中，Prime before run前打勾。保持25℃设置不变。点击Next，进入下一步。根据样品架位置表，依次放入准备好的溶液。将样品架送回样品舱，点击Next，弹出Prepare Run Protocol对话框。仔细检查所列事项，确认左侧架子上的运行缓冲液体积大于软件中所显示的最低要求。点击Start。
[0031]所述的步骤(2)具体为：挑取肠炎沙门菌C50041单菌落接种于LB液体培养基中培养过夜，随后菌液以1:100的比例接种于6mL LB液体培养基，37℃，22本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用表面等离子体共振技术检测沙门菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：制备沙门菌检测芯片；培养待测细菌，将待测细菌与抗体孵育，游离抗体分离，通过梯度离心，将未与细菌结合的抗体分离出来；采用表面等离子体共振技术检测游离抗体的响应信号，进而计算得到待测沙门菌的含量；所述的抗体为沙门菌PagN蛋白单克隆抗体。2.根据权利要求1所述的利用表面等离子体共振技术检测沙门菌的方法，其特征在于，所述沙门菌PagN蛋白单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区包含V
H CDR1、V
H CDR2和V
H CDR3，所述轻链可变区包含V
L CDR1、V
L CDR2和V
L CDR3；所述的V
H CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示；所述的V
H CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示；所述的V
H CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示；所述的V
L CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示；所述的V
L CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO：5所示；所述的V
L CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO：6所示。3.根据权利要求2所述的利用表面等离子体共振技术检测沙门菌的方法，其特征在于，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。4.根据权利要求2所述的利用表面等离子体共振技术检测沙门菌的方法，其特征在于，重链氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示；轻链氨基酸序列如SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：焦新安，胡茂志，朱洪吉，孟闯，潘志明，丁睿清，康喜龙，顾丹，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：