改善的聚乙烯亚胺聚乙二醇载体制造技术

提供双链RNA和聚合缀合物的多聚物，其中所述聚合缀合物由与一个或多个聚乙二醇(PEG)部分共价连接的线型聚乙烯亚胺组成，各PEG部分经接头与能够结合癌症抗原的靶向部分缀合。分经接头与能够结合癌症抗原的靶向部分缀合。

【技术实现步骤摘要】
改善的聚乙烯亚胺聚乙二醇载体
[0001]本申请是申请日为2015年5月14日、申请号为201580025099.3、专利技术名称为“改善的聚乙烯亚胺聚乙二醇载体”的专利技术专利申请的分案申请。
专利

[0002]本专利技术涉及与能够结合癌症抗原的靶向部分缀合的非病毒的基于聚乙烯亚胺的多聚物(polyplexes)。
[0003]专利技术背景
[0004]分子医学面临的障碍之一是治疗物质如DNA或RNA分子的靶向递送。新兴的策略是非病毒载体的构建，如阳离子聚合物和阳离子脂类，其结合并凝聚核酸。这些非病毒的阳离子载体相比于病毒基因载体具有许多优势，因为它们是非免疫原性的、非致癌的并且容易合成[1
‑
4]。目前，正发展数种合成的聚阳离子聚合物用于核酸的递送。在这些聚合物中，聚乙烯亚胺(PEI)被认为是用于基因递送的最有希望的物质[5]。
[0005]PEI是水溶性的有机大分子，其可以以线型和分枝型结构的形式获得[6]。PEI随着广泛的pH改变其离子化的程度，因为它们骨架链中的每三个原子是可以质子化的氨基氮。PEI中大约55％的氮在在生理pH下是质子化的[7]。它们具有高的阳离子电荷密度，因此能够与核酸形成非共价的复合体。而且，可以通过各种化学修饰改变它们的物理化学和生物特性[8]。基于PEI的复合体(也被称为多聚物(polyplexes))可被许多细胞类型内吞[9]。多聚物内化后，通过“质子海绵效应”促使内体释放和高效的基因转移[10]。PEI凝聚DNA的能力似乎是将大的DNA构建体递送进许多细胞类型中的重要因子。
[0006]利用PEI作为递送载体的主要担忧是毒性，由于它们高的表面正电荷，其可以导致非特异性结合[11]。最近尝试改善非病毒载体的选择性和生物相容性。这导致用聚乙二醇(PEG)修饰PEI分子，为了屏蔽PEI颗粒[12]。异源双功能PEG基团与PEI的缀合促进PEI与靶配体的耦合，其向具有相应受体的细胞提供了高效的基因递送[12]。我们之前描述了靶载体的产生，其表明与EGF相连作为靶载体的分枝型PEI(brPEI
‑
EGF)和线型PEI(LPEI)之间的差异[13，WO 2004/045491，WO 2010/073247]。当前的合成方法不令人满意，因此它们导致不足够的同源产物。因此紧迫需要可以以可再生的方式将靶向部分与LPEI
‑
PEG高效缀合的方法，以产生可靠地用于治疗癌症的方法中的均质批次的产物。
[0007]专利技术概述
[0008]在一个方面，本专利技术涉及双链RNA(dsRNA)和聚合缀合物的多聚物，其中所述聚合缀合物由与一个或多个聚乙二醇(PEG)部分共价连接的线型聚乙烯亚胺(LPEI)组成，各PEG部分经接头与能够结合癌症抗原的靶向部分缀合，条件是所述靶向部分不是小鼠EGF(mEGF)或序列YHWYGYTPQNVI(GE11)(SEQ ID NO:1)的肽。
[0009]在另一方面，本专利技术提供药物组合物，其包含药学可接受的载体和如本文所述的专利技术的多聚物。
[0010]而在另一方面，本专利技术提供用于治疗选自以下的癌症的如本文所述的专利技术的多聚物，或者包含所述多聚物的药物组合物：以EGFR过表达的细胞为特点的癌症、以HER2过表达
的细胞为特点的癌症和前列腺癌。
[0011]在另一方面，本专利技术涉及用于治疗选自以下的癌症的方法：以EGFR过表达的细胞为特点的癌症、以HER2过表达的细胞为特点的癌症和前列腺癌，所述方法包括向需要的对象施用如本文所述的专利技术的多聚物。
[0012]在又一方面，本专利技术涉及用于治疗癌症的包含药学可接受的载体和本专利技术的多聚物的药物组合物，所述癌症选自：以EGFR过表达的细胞为特点的癌症、以HER2过表达的细胞为特点的癌症和前列腺癌。
[0013]可以将本专利技术的多聚物与免疫细胞联合使用。
[0014]附图简述
[0015]图1显示LPEI(
‑
22kDa)与NHS
‑
PEG
‑
OPSS(～2kDa)的缀合主要产生两种聚乙二醇化程度不同的共聚合网络。共聚物LPEI
‑
(PEG
2k
‑
OPSS)3(“1:3双缀合物”)平均由1摩尔LPEI和3摩尔PEG组成，而共聚物LPEI
‑
PEG
2k
‑
OPSS(“1:1双缀合物”)平均由1摩尔比例的LPEI和1摩尔PEG组成(通过1H
‑
NMR分析测定LPEI:PEG的比例)。
[0016]图2显示两种双缀合物(LPEI
‑
PEG
2k
‑
OPSS(1:1双缀合物)和LPEI
‑
(PEG
2k
‑
OPSS)3(1:3双缀合物))的1H
‑
NMR分析。通过化学位移的存在指示PEG基团与LPEI的偶联，所述化学位移与位于3.7ppm(a)的乙二醇氢和位于
‑
3.0ppm(b)的乙亚胺氢有关。这些峰的整数值提供PEG与LPEI的摩尔比，从中推理所阐述的1:1双缀合(A)和1:3双缀合(B)的结构。
[0017]图3显示共聚合网络(1:1双缀合物和1:3双缀合物)与亲和体(affibody)(“Her
‑
2”)通过二硫化物交换缀合的流程图，导致两种有差异的聚二乙醇化三缀合物的产生[20]。
[0018]图4描述了纯化的亲和体、双缀合物和三缀合物在不存在和存在DTT情况下的SDS/PAGE。在存在DTT的情况下，亲和体从三缀合物释放，并且在纯化的亲和体旁边移动(稍微在10kDa上面)。
[0019]图5显示使用DLS测量与在HBG缓冲液pH 7.4中的质粒pGreenfire 1复合的LPEI、双缀合物和三缀合物的颗粒大小。
[0020]图6描述了与质粒pGreenfire 1复合的LPEI、双缀合物和三缀合物的ξ电位分布。通过DLS测量ξ电位，以及通过Smoluchowski方程式进行计算。
[0021]图7A
‑
B显示源自在HBG缓冲液(pH 7.4)中进行测量的两种多聚物的原子力显微镜(AFM)图像。(A)1:1三缀合物多聚物(B)1:3三缀合物多聚物。比例尺是1μm。
[0022]图8描述了显示有差异的聚二乙醇化多聚物保护质粒pGreenFirel免受DNase I降解的琼脂糖凝胶。用或不用DNase I(2IU)处理单独的1μg质粒(pGreenFirel)或者含1μg质粒(pGreenFirel)的1:1三缀合物多聚物和1:3三缀合物多聚物。超螺旋质粒(s.c.)，开环质粒(o.c.)。
[0023]图9A
‑
C显示使用分别含有LPEI:PEG比例为1:1和LPEI:PEG比例为1:3的1:1三缀合物多聚物和1:3三缀合物多聚物的pGFP
本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.双链RNA(dsRNA)和聚合缀合物的多聚物，其中所述聚合缀合物由与一个或多个聚乙二醇(PEG)部分共价连接的线型聚乙烯亚胺(LPEI)组成，各PEG部分经接头与能够结合癌症抗原的靶向部分缀合，并且其中所述靶向部分是HOOC(CH2)2‑
CH(COOH)
‑
NH
‑
CO
‑
NH
‑
CH(COOH)
‑
(CH2)2‑
CO
‑
(2
‑
[3
‑
(1,3
‑
二羧基丙基)脲基]戊二酸(DUPA)残基)，条件是所述靶向部分不是小鼠EGF或序列YHWYGYTPQNVI(GE11)(SEQ ID NO:1)的肽。2.双链RNA(dsRNA)和聚合缀合物的多聚物，其中所述聚合缀合物由与一个或多个聚乙二醇(PEG)部分共价连接的线型聚乙烯亚胺(LPEI)组成，各PEG部分经接头与能够结合癌症抗原的靶向部分缀合，并且其中所述靶向部分是hEGF，条件是所述靶向部分不是小鼠EGF或序列YHWYGYTPQNVI(GE11)(SEQ ID NO:1)的肽。3.双链RNA(dsRNA)和聚合缀合物的多聚物，其中所述聚合缀合物由与一个或多个聚乙二醇(PEG)部分共价连接的线型聚乙烯亚胺(LPEI)组成，各PEG部分经接头与能够结合癌症抗原的靶向部分缀合，条件是所述靶向部分不是小鼠EGF或序列YHWYGYTPQNVI(GE11)(SEQ ID NO:1)的肽。4.如权利要求1至3中任一项所述的多聚物，其中所述dsRNA是聚肌胞苷酸双链RNA(聚I:C)，所述聚合缀合物由与一个PEG部分共价连接的LPEI组成(LPEI
‑
PEG 1:1)或者与三个PEG部分共价结合的LPEI组成(LPEI
‑
PEG 1:3)，以及所述癌症抗原是表皮生长因子受体(EGFR)、人表皮生长因子受体2(HER2)或前列腺表面膜抗原(PSMA)。5.如权利要求1至4中任一项所述的多聚物，其中所述一个或多个PEG部分与所述LPEI各自独立地形成
‑
NH
‑
CO
‑
键，以及与所述接头各自独立地形成选自
‑
NH
‑
CO
‑
、
‑
CO
‑
NH
‑
、
‑
S
‑
C
‑
、
‑
S
‑
S
‑
、
‑
O
‑
CO
‑
或
‑
CO
‑
O
‑
的键，并且优选地其中所述一个或多个PEG部分中的每一个与所述LPEI和所述接头形成
‑
NH
‑
CO
‑
键。6.如权利要求1至5中任一项所述的多聚物，其中所述接头与所述靶向部分形成
‑
S
‑
S
‑
键、NH
‑
CO
‑
键、
‑
CO
‑
NH
‑
键、
‑
S
‑
C
‑
键、O
‑
CO
‑
键、
‑
CO
‑
O
‑
键或(
‑
NH
‑
CO
‑
NH)脲键，其中优选地所述接头选自
‑
CO
‑
R2‑
R
X
‑
R3或者由3至7个氨基酸残基组成肽部分，其中R2选自：(C1‑
C8)亚烷基、(C2‑
C8)亚烯基、(C2‑
C8)亚炔基、(C6‑
C
10
)亚芳基
‑
二基或亚杂芳基二基；R
x
不存在或为
‑
S
‑
；R3不存在或是式R4选自：(C1‑
C8)亚烷基、(C2‑
C8)亚烯基、(C2‑
C8)亚炔基、(C1‑
C8)亚烷基
‑
(C3‑
C8)亚环烷基、(C2‑
C8)亚烯基
‑
(C3‑
C8)亚环烷基、(C2‑
C8)亚炔基
‑
(C3‑
C8)亚环烷基、(C6‑
C
10
)亚芳基
‑
二基、亚杂芳基二基、(C1‑
C8)亚烷基
‑
(C6‑
C
10
)亚芳基
‑
二基或(C1‑
C8)亚烷基
‑
亚杂芳基二基；其中所述(C1‑
C8)亚烷基、(C2‑
C8)亚烯基或(C2‑
C8)亚炔基中的每一个被各自独立地选自以下的一个或多个基团独立取代：卤素、
‑
COR5、
‑
COOR5、
‑
OCOOR5、
‑
OCON(R5)2、
‑
CN、
‑
N02、
‑
SR5、
‑
OR5、
‑
N(R5)2、
‑
CON(R5)2、
‑
SO2R5、
‑
SO3H、
‑
S(＝O)R5、(C6‑
C
10
)芳基、(C1‑
C4)亚烷基
‑
(C6‑
C
10
)芳基、杂芳基或(C1‑
C4)亚烷基
‑
杂芳基，并且还被一个或多个相同或不同的选自S、O或N
的杂原子，和/或各自独立地选自
‑
NH
‑
CO
‑
、
‑
CO
‑
NH
‑
、
‑
N(R5)
‑
、
‑
N(C6‑
C
10
芳基)
‑
、(C6‑
C
10
)亚芳基
‑
二基或亚杂芳基二基的至少一个基团任选间隔；以及R5是H或(C1‑
C8)烷基；并且其中进一步优选地R2选自(C1‑
C8)亚烷基，优选(C1‑
C4)亚烷基，所述R2被各自独立地选自以下的一个或多个基团独立取代：卤素、
‑
COH、
‑
COOH、
‑
OCOOH、
‑
OCONH2、
‑
CN、
‑
NO2、
‑
SH、
‑
OH、
‑
NH2、
‑
CONH2、
‑
SO2H、
‑
SO3H、
‑
S(＝O)H、(C6‑
C
10
)芳基、(C1‑
C4)亚烷基
‑
(C6‑
C
10
)芳基、杂芳基或(C1‑
C4)亚烷基
‑
杂芳基，并...

【专利技术属性】
技术研发人员：亚历克斯，
申请(专利权)人：塔歌牧恩治疗公司，
类型：发明
国别省市：