一种经硫代磷酸化修饰的核酸序列的修饰鉴定方法技术

本说明书实施例提供一种经硫代磷酸化修饰的核酸序列的修饰鉴定方法，该方法包括：利用核酸混合酶对待鉴定核酸序列进行酶解，获得酶解产物；基于第一质谱信息对所述酶解产物进行二级质谱分析；以及，基于所述第一质谱信息与所述第二质谱信息，确定所述待鉴定核酸序列中是否存在目标序列片段。其中，至少经硫代磷酸化修饰的所述待鉴定核酸序列是基于预设修饰规则而实际获得的；所述第一质谱信息包括对理论序列片段通过分析产生的理论分析结果，所述理论序列片段是基于所述预设修饰规则、所述待鉴定核酸序列和所述核酸混合酶确定的。该修饰鉴定方法可准确、高效地进行经硫代磷酸化修饰的核酸序列的化学修饰鉴定。饰的核酸序列的化学修饰鉴定。饰的核酸序列的化学修饰鉴定。

【技术实现步骤摘要】
一种经硫代磷酸化修饰的核酸序列的修饰鉴定方法
交叉引用
[0001]本申请要求2022年4月29日提交的中国申请202210467473.7的优先权，全部内容通过引用的方式整体并入本文。


[0002]本说明书涉及核酸检测
，特别涉及一种经硫代磷酸化修饰的核酸序列的修饰鉴定方法。

技术介绍

[0003]核酸序列的修饰鉴定方法主要用于鉴定核酸序列的化学修饰是否符合预期设计，其在生物、医学和药物研究及生产活动中具有广泛的应用。例如，广泛用于基因编辑的CRISPR/Cas9系统由Cas9蛋白和sgRNA(single guide RNA)组成。sgRNA是根据crRNA和tracrRNA形成的高级结构设计的，与Cas9核酸酶蛋白结合，指导其识别并剪辑靶向序列。由于CRISPR/Cas9来自于原核生物天然获得性免疫系统抵御外来遗传物质的防御系统，Cas9核酸酶可能继承了序列特异性低的特点，使其非特异性切割的几率增加，造成脱靶效应增多。因此，通常需要对Cas9和sgRNA进行化学修饰或编辑，以降低脱靶效应。sgRNA作为CRISPR基因编辑技术的关键原料，在进行临床申报时需对其进行质量研究，即需要对sgRNA序列5
’
端和3
’
端的修饰进行鉴定。对于5
’
端和3
’
端分别带有硫代磷酸化修饰的sgRNA，若直接采用LC
‑
MS方法进行全长序列的分子量鉴定，由于该分子量鉴定无法体现出带有化学修饰的核酸序列的核苷酸排列顺序，因而无法判断对应化学修饰是否是基于正确的序列排列进行的，使得鉴定结果不准确。因此，有必要提供一种准确、高效的经硫代磷酸化修饰的核酸序列的修饰鉴定方法。

技术实现思路

[0004]本说明书一个或多个实施例提供一种经硫代磷酸化修饰的核酸序列的修饰鉴定方法。所述方法包括：利用核酸混合酶对待鉴定核酸序列进行酶解，获得酶解产物；其中，所述待鉴定核酸序列是基于预设修饰规则而实际获得的，所述待鉴定核酸序列的待鉴定的修饰至少包括核苷酸间连接的硫代磷酸化修饰；基于第一质谱信息对所述酶解产物进行二级质谱分析，获得所述酶解产物实际产生的第二质谱信息，其中，所述第一质谱信息包括对理论序列片段通过分析产生的理论分析结果，所述理论序列片段是基于所述预设修饰规则、所述待鉴定核酸序列和所述核酸混合酶确定的；以及基于所述第一质谱信息与所述第二质谱信息，确定所述待鉴定核酸序列中是否存在与所述理论序列片段一致的目标序列片段。
[0005]在一些实施例中，所述核酸混合酶能够破坏磷酸二酯键且免于破坏硫代磷酸酯键，以使经硫代磷酸化修饰的所述待鉴定核酸序列产生至少两种不同分子量的序列片段。
[0006]在一些实施例中，所述核酸混合酶包括蛇毒磷酸二酯酶和/或牛脾磷酸二酯酶。
[0007]在一些实施例中，所述核酸混合酶的酶解时间为1h～8h。
[0008]在一些实施例中，所述核酸混合酶的酶解时间为3h～5h。
[0009]在一些实施例中，所述待鉴定核酸序列的待鉴定的修饰还可包括戊糖的修饰和/或碱基的修饰。
[0010]在一些实施例中，所述戊糖的修饰包括以下修饰中的至少一种：2
’‑
修饰、5
’‑
修饰、3
’‑
修饰、锁核酸修饰、解锁核酸修饰和肽核酸修饰。
[0011]在一些实施例中，所述戊糖的2
’‑
修饰包括以下修饰中的至少一种：2
’‑
O
‑
甲基修饰、2
’‑
氟代修饰、2
’‑
O
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甲氧乙基修饰、2
’‑
O
‑
甲基化修饰、2
’‑
O
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烯丙基修饰。
[0012]在一些实施例中，所述碱基的修饰包括以下修饰中的至少一种：甲基化修饰和羟甲基化修饰。
[0013]在一些实施例中，所述预设修饰规则包括：经修饰的戊糖所对应的核苷酸与至少一个相邻核苷酸之间通过硫代磷酸酯键连接；和/或，所述预设修饰规则包括：经修饰的碱基所对应的核苷酸与至少一个相邻核苷酸之间通过硫代磷酸酯键连接。
[0014]在一些实施例中，所述预设修饰规则包括：所述待鉴定核酸序列的5
’
端和/或3
’
端具有经修饰的序列片段，所述经修饰的序列片段的长度为2～5个核苷酸，所述经修饰的序列片段中相邻核苷酸之间通过硫代磷酸酯键连接。
[0015]在一些实施例中，所述理论序列片段的相邻核苷酸之间通过硫代磷酸酯键连接。
[0016]在一些实施例中，所述第一质谱信息包括所述理论序列片段的第一母离子信息和第一子离子信息；其中，所述第一母离子信息至少包括第一母离子的质荷比，所述第一子离子信息至少包括第一子离子的互补配对信息和质荷比。
[0017]在一些实施例中，所述第二质谱信息包括第二母离子信息和第二子离子信息；所述获得所述酶解产物实际产生的第二质谱信息包括：基于所述第一母离子信息确定所述第二母离子信息，所述第二母离子信息至少包括第二母离子的质荷比；基于所述第二母离子信息进行所述酶解产物的二级质谱分析，获得第二子离子信息，所述第二子离子信息至少包括第二子离子的互补配对信息和质荷比。
[0018]在一些实施例中，所述确定所述待鉴定核酸序列中是否存在与所述理论序列片段一致的目标序列片段包括：确定所述第一子离子信息与所述第二子离子信息是否满足预设匹配条件；若满足预设匹配条件，则确定所述待鉴定核酸序列中存在所述目标序列片段。
[0019]在一些实施例中，所述预设匹配条件为：存在至少一对第一子离子和至少一对第二子离子，所述至少一对第一子离子与所述至少一对第二子离子的互补配对信息和质荷比相同。
[0020]在一些实施例中，所述酶解产物的二级质谱分析通过线性离子井质谱联用仪进行。
附图说明
[0021]本说明书将以示例性实施例的方式进一步说明，这些示例性实施例将通过附图进行详细描述。这些实施例并非限制性的，在这些实施例中，相同的编号表示相同的结构，其中：
[0022]图1是根据本说明书一些实施例所示的修饰鉴定方法的示例性流程图；
[0023]图2是本说明书实施例1的对照样品1的LC
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MS质谱图；
[0024]图3是本说明书实施例1的对照样品2的LC
‑
MS质谱图；
[0025]图4是本说明书实施例1的混合酶反应缓冲液的LC
‑
MS总离子流图；
[0026]图5是本说明书实施例1的混合酶反应缓冲液的LC
‑
MS质谱图；
[0027]图6是本说明书实施例2的样品1酶解2min的酶解产物的LC
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MS质谱图；
[0028]图7是本说明书实施例2的样品1酶解4h的酶解产物的LC
‑
MS质本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种经硫代磷酸化修饰的核酸序列的修饰鉴定方法，其特征在于，所述方法包括：利用核酸混合酶对待鉴定核酸序列进行酶解，获得酶解产物；其中，所述待鉴定核酸序列是基于预设修饰规则而实际获得的，所述待鉴定核酸序列的待鉴定的修饰至少包括核苷酸间连接的硫代磷酸化修饰；基于第一质谱信息对所述酶解产物进行二级质谱分析，获得所述酶解产物实际产生的第二质谱信息，其中，所述第一质谱信息包括对理论序列片段通过分析产生的理论分析结果，所述理论序列片段是基于所述预设修饰规则、所述待鉴定核酸序列和所述核酸混合酶确定的；以及基于所述第一质谱信息与所述第二质谱信息，确定所述待鉴定核酸序列中是否存在与所述理论序列片段一致的目标序列片段。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸混合酶能够破坏磷酸二酯键且免于破坏硫代磷酸酯键，以使经硫代磷酸化修饰的所述待鉴定核酸序列产生至少两种不同分子量的序列片段。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述核酸混合酶包括蛇毒磷酸二酯酶和/或牛脾磷酸二酯酶。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸混合酶的酶解时间为1h～8h。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸混合酶的酶解时间为3h～5h。6.如权利要求1
‑
5中任一项所述的方法，其特征在于，所述待鉴定核酸序列的待鉴定的修饰还可包括戊糖的修饰和/或碱基的修饰。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述戊糖的修饰包括以下修饰中的至少一种：2
’‑
修饰、5
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修饰、3
’‑
修饰、锁核酸修饰、解锁核酸修饰和肽核酸修饰。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述戊糖的2
’‑
修饰选自2
’‑
O
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甲基修饰、2
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氟代修饰、2
’‑
O
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甲氧乙基修饰、2
’‑
O
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甲基化修饰、2
’‑
O
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烯丙基修饰。9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述碱基的修饰包括以下修饰中的至少一种：甲基化修...

【专利技术属性】
技术研发人员：祁明盼，刘红柳，刘吉众，王建鹏，李竑，
申请(专利权)人：南京金斯瑞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：