一种NIR活化的亚甲基蓝聚氨基酸共递送一氧化氮的级联放大光动力的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种NIR活化的亚甲基蓝聚氨基酸共递送一氧化氮的级联放大光动力的应用，包括10

【技术实现步骤摘要】
一种NIR活化的亚甲基蓝聚氨基酸共递送一氧化氮的级联放大光动力的应用


[0001]本专利技术涉及生化医药领域，具体而言，涉及一种NIR活化的亚甲基蓝聚氨基酸共递送一氧化氮的级联放大光动力的应用。

技术介绍

[0002]光动力疗法(PDT)由于其独特的时空选择性、深度渗透、无创和对正常组织的低光损伤，近年来受到了越来越多的关注。PDT的效率主要由三个关键因素：光、光敏剂(PS)和氧决定，其中光敏剂可以在光照射肿瘤组织时与氧反应生成光毒性ROS。近年来，疏水聚集诱导的PS失活和肿瘤细胞内缺氧导致的O2不足被认为是PDT低ROS的主要障碍。
[0003]为了克服疏水聚集诱导PS失活的问题，开发了多种PS释放到肿瘤特异活性位点的刺激响应性纳米载体，例如肿瘤微环境(TME)独特的pH、氧化还原、某些酶响应性聚合物胶束、脂质体和其他无机纳米材料。然而，由于纳米载体中的物理掺入导致的脱靶诱导的全身毒性和由肿瘤部位的异质TME引发的不受控制的PS释放极大地阻碍了PS递送的生物安全性和效率。基于PS前药的两亲性缀合物，特别是通过NIR光切割键连接，不仅可本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种NIR活化的亚甲基蓝聚氨基酸共递送一氧化氮的级联放大光动力的应用，其特征在于，包括10
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N
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氨基甲酰基连接亚甲基蓝与水溶性聚乙二醇聚赖氨酸，所述10
‑
N
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氨基甲酰基连接亚甲基蓝即为MB，所述水溶性聚乙二醇聚赖氨酸即为mPEG
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PLL，所述mPEG
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PLL和所述MB通过偶联获得两亲性mPEG
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PLL
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MB，两亲性的聚合物所述mPEG
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PLL
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MB通过自组装成纳米粒子；还包括有NO前药，所述NO前药即为JSK，所述JSK和所述mPEG
‑
PLL
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MB通过π
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π堆叠相互作用形成mPEG
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PLLMB/JSK，并且在肿瘤细胞摄取到共同递送的所述mPEG
‑
PLL MB/JSK，所述mPEG
‑
PLL MB/JSK在NIR光下释放并激活所述MB，此时所述MB从光淬灭状态转换为光活性状态，以及在疏水性所述MB裂解的过程中是，自组装成纳米粒子的所述mPEG
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PLL
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MB会发生解体，然后释放所述JSK，所述JSK被肿瘤细胞内过表达的GSH/GST进一步触发以释放NO，然后，NO作为O2节约剂通过抑制细胞呼吸MRCⅠ和IV，从而缓解实体瘤中的缺氧，基于所述MB的激活和NO的缺氧缓解，以及在NO释放过程中GSH的消耗，三者联合实现了级联ROS扩增，随后，ROS上调线粒体凋亡蛋白，提高PDT在体内抑制肿瘤的效率。2.根据权利要求1所述的一种NIR活化的亚甲基蓝聚氨基酸共递送一氧化氮的级联放大光动力的应用，其特征在于，所述mPEG
‑
PLLMB的合成过程如下：首先，合成mPEG
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PLL肽：将重量为7.6g的H
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Lys(Z)
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OH溶于80mL的无水THF中，滴加3.4g的三光气，并在50℃、N2保护下反应；3小时后，将混合物在干燥的THF/正己烷中重结晶两次，得到Lys
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NCA(Z)；然后将0.2g的Z
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Lys
‑
NCA和0.1g的氨基封端的PEG溶解在无水N，N
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二甲基甲酰胺中，反应在50℃、N2保护下进行3天；将反应液在过量乙醚中沉淀三次获得mPEG
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PLL(Z)；随后，使用10mL TFA和5mLHBr溶液将0.15g的mPEG
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PLL(Z)脱保护1小时；然后，将脱保护的粗产物在过量的乙醚中沉淀，将沉淀重新溶解在DMF中，用蒸馏水透析(MWCO：3500Da)3天，通过冷冻干燥获得PEG
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PLL；然后，通过PEG
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PLL和MB
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NC的反应制备了mPEG
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PLL
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MB聚合物；将4.0g，1.84mmol的mPEG
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PLL和259μL，2.0mmol的TEA溶于无水DCM中，滴加1.34g，2.5mmol的MB
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NC溶液，反应在室温下过夜；将反应混合物在乙醚中沉淀，得到mPEG
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PLL
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MB的浅蓝色粉末；再通过1HNMR、FTIR和UV光谱对mPEG
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PLL和mPEG
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PLL
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MB的化学结构进行表征；使用芘作为疏水荧光探针检测mPEG
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PLL
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MB NPs胶束的临界胶束浓度；mPEG
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PLLMB溶液的浓度范围为0.00001至0.1mg/mL，滴加芘
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丙酮溶液并搅拌，确保最终探针浓度为6
×
10
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7M；混合物通过荧光光谱测量，激发波长为373nm，发射波长为480nm；荧光强度比曲线(I341/I336)和聚合物浓度的对数，交点是mPEG
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PLL
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MB值的CMC。3.根据权利要求1所述的一种NIR活化的亚甲基蓝聚氨基酸共递送一氧化氮的级联放大光动力的应用，其特征在于，所述mPEG
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PLLMB/JSK的合成步骤如下：采用纳米沉淀法制备mPEG
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PLL
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MB/JSK纳米粒子：将5mg的mPEG
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PLL
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MB肽和1mg的NO前药JSK溶于0.5mL乙腈中，在室温搅拌下将溶液滴加到3mL去离子水中搅拌24小时44；随后，将混合物以8000rpm离心10分钟，再收集上清液，且上清液为mPEG
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PLL MB/JSK NPs溶液，通过DLS和TEM观察mPEG
‑
PLL MB/JSK纳米颗粒的粒度和ζ。4.根据权利要求3所述的一种NIR活化的亚甲基蓝聚氨基酸共递送一氧化氮的级联放大光动力的应用，其特征在于，所述mPEG
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PLL
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MB/JSKNPs溶液在37℃下以及含有5％血清的RPMI
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1640培养基中孵育，通过DLS测定mPEG
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PLL
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MB/JSKNPs的平均大小；此外，通过mPEG
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PLL
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MB溶液，基于MB剂量：10μg/mL和乙腈、mPEG
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PPLL
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MB纳米颗粒、mPPE
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PLLMB/JSK溶液，基于MB浓度：10μg/mL和丙酮、mPEG PLL
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MB/JSK纳米颗粒的紫外吸收变化，研究了mPEG
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PLL
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MB/JSKNPs中MB和JSK之间的π
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π堆积作用；通过紫外光谱测定mPEG
‑
PLL
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MB/JSK纳米颗粒中JSK的负载量；将10mg的mPEG
‑
PLL
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MB/JSK NPs完全溶解在1mL乙腈中，通过紫外光谱在302nm的吸收波长检测JSK的吸收；负载量和封装效率通过以下公式计算：JSK的负载量％(wt/wt)＝(负载的JSK的重量)/(NP的重量)
×
100％；JSK的封装效率％(wt/wt)＝(负载重量JSK)/(总JSK重量)。5.根据权利要求1所述的一种NIR活化的亚甲基蓝聚氨基酸共递送一氧化氮的级联放大光动力的应用，其特征在于，所述NIR激活MB和增强的ROS产生：通过荧光和紫外光谱研究mPEG
‑
PLLMB/JSKNP的NIR光裂解MB：将1mg/mL的mPEG
‑
PLL MB/JSKNPs溶液用NIR照射，所述NIR照射的光波长为660nm，出纤功率为100mW cm
‑2，照射时间为0至40min，并且采用石蜡膜密封溶液防止照射过程中溶剂蒸发，通过660nm激发波长和685nm发射波长的荧光光谱检测活化MB的荧光；此外，用NIR辐射照射1mg/mL的mPEG
‑
PLL
‑
MB/JSKNPs溶液，所述NIR辐射的光波长为660nm，出纤功率为100mW cm
‑2；时间从0分钟延长至5分钟，记录活化MB的波长685nm和游离JSK的波长302nm的紫外光谱。6.根据权利要求5所述的一种NIR活化的亚甲基蓝聚氨基酸共递送一氧化氮的级联放大光动力的应用，其特征在于，所述mPEG
‑
PLL
‑
MB/JSK纳米颗粒在NIR照射下的裂解，即将1mg/mL的mPEG
‑
PLL
‑
MB/JSKNPs溶液在0分钟至40分钟的时间内进行NIR辐照，通过动态光散射测试尺寸和尺寸分布，并通过透射电子显微镜表征辐照40分钟后纳米颗粒的形态变化；近红外辐射后mPEG
‑
PLLMB/JSK纳米颗粒的单线态氧(ROS)产生，将1μLDPBF荧光探针添加到200μL mPEG
‑
PLL
‑
MB/JSK纳米颗粒溶液中，所述DPBF荧光探针是将5mg/mL溶解于DMSO中，并在不同时间进行近红外辐射，且光波长为660nm，出纤功率为100mW cm
‑2，通过酶标仪在波长404nm下测试样品。7.根据权利要求1所述的一种NIR活化的亚甲基蓝聚氨基酸共递送一氧化氮的级联放大光动力的应用，其特征在于，所述GSH/GST的触发NO释放和GSH消耗：所述mPEG
‑
PLL
‑
MB/JSKNPs的细胞内NO释放的研究，将4T1细胞接种到约100000个细胞的35mm玻璃底皿中，加入含有PBS、mPEG
‑
PLL
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MB、mPEG
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PLL
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MB/JSK、mPEG
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PLL
‑
MB+NIR，MB：20μg mL
‑1、mPEG
‑
PLL
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MB/JSK+NIR的新鲜培养基以孵育细胞24小时；将细胞用5μM DAF
‑
FM染色20分钟，即NO探针，然后用4％甲醛固定细胞，并用DAPI染色细胞核；通过CLSM检测DAF
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FM的荧光来评估细胞内NO释放；为了定量评估NO释放，上述药物处理和DAF
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FM探针染色后的细胞进行洗涤并通过流式细胞仪分析收集；随后，使用Griess试剂盒进一步检测纳米颗粒的细胞内累积NO释放；4T1细胞在共聚焦培养皿中以每孔100000个细胞培养，PBS、mPEG
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PLL
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MB、mPEG
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PLL
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MB/JSK、mPEG
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PLL
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MB+NIR、mPEG
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PLL
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MB/JSK+NIR的新鲜培养基添加到每个孔中，并在预定时间孵育，添加培养基，通过酶标仪监测释放的NO；在GSH/GST触发JSK释放NO期间，使用PBS和4T1细胞中的GSH测定试剂盒评估GSH的消耗；将不同摩尔比的mPEG
‑
PLL
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MB/JSKNPs/GSH溶液与固定的10mM的GSH和5μg/mL的GST在PBS中孵育24小时，不同摩尔比为0，1：5，1：3，1：1，5：1，3：1；通过波长420nm的UV
‑
vis光谱检测GSH水平；然后，在4T1细胞中测量mPEG
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PLL
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MB/JSK NP的细胞内GSH消耗；将4T1细胞接种
到六孔板中每孔约500000个细胞，并用不同组PBS、mPEG
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PLL
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MB、mPEG
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PLL...

【专利技术属性】
技术研发人员：张计敏，张宇，陈小爱，赵鹏，徐畅，郭靖喆，瞿雄伟，
申请(专利权)人：河北工业大学，
类型：发明
国别省市：