一种血清中25-羟基维生素D的检测方法技术

本发明专利技术涉及医学检测技术领域，尤其涉及一种血清中25

【技术实现步骤摘要】
一种血清中25
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羟基维生素D的检测方法


[0001]本专利技术涉及医学检测
，尤其涉及一种血清中25
‑
羟基维生素D的检测方法。

技术介绍

[0002]维生素是维持机体正常生理功能、维持细胞内特异代谢反应所必须的一类小分子有机物，是人体健康所必须的一类基本营养物质，在调节物质代谢过程中发挥重要作用。维生素D属于脂溶性维生素，是调节骨代谢的重要维生素，婴幼儿缺乏维生素D会导致佝偻病，成人缺乏会导致骨质疏松症。当机体摄入并蓄积过量的维生素D时，体内维生素D负反馈调节作用失调，会导致高钙血症及一系列不良反应如恶心、呕吐、便秘、胰腺炎、急性肾脏损伤等。25
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羟基维生素D半衰期较长，体内存在形式稳定且浓度较高，是监测体内维生素D营养水平的标志物。25
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羟基维生素D2和25
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羟基维生素D3是25
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羟基维生素D在血液循环中的主要存在形式，可作为维生素D的检测指标，因此，监测人体内25
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羟基维生素D2和25
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羟基维生素D3的含量，有助于评价人体维生素D的状况。
[0003]现有技术中，已有众多的诊断检测人血清中25
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羟基维生素D的高效液相色谱方法，但是对血清样本预处理之后杂质干扰仍然较多。

技术实现思路

[0004]为了尽可能的去除杂质干扰物，使得高效液相色谱的进样中的25
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羟基维生素D更加富集，提高高效液相色谱检测25
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羟基维生素D的灵敏度和准确度，本专利技术采用SPE板对血清中25
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羟基维生素D进行富集。本专利技术发现，采用SPE板处理血清时，经过蛋白沉淀的沉淀液经过SPE板时易出现堵孔现象。为解决这一技术难题，提出下述
技术实现思路
。
[0005]本专利技术提供了一种血清中25
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羟基维生素D的检测方法，包括：将样本与硫酸锌、甲醇和乙腈混合制得沉淀液，过滤所述沉淀液制得滤液，采用SPE板纯化所述滤液，制得纯化样本；然后采用高效液相色谱法检测所述纯化样本。
[0006]本专利技术通过对蛋白沉淀剂的大量筛选，发现选择硫酸锌、甲醇和乙腈的组合对血清样本进行沉淀时，过滤后的滤液中的蛋白等杂质经过SPE板时，不会发生堵孔现象，而且蛋白沉淀效果好，沉淀固体均匀分布在蛋白沉淀板底部。
[0007]此外，采用SPE板前处理的方式收集的洗脱液远远低于液液萃取的体积，大幅缩短了后续氮吹时间。
[0008]优选地，甲醇和乙腈的体积比为1：（0.8~1.2）。
[0009]在上述配比下，蛋白沉淀效果更佳。
[0010]优选地，以样本、硫酸锌、甲醇和乙腈的总体积计，硫酸锌的浓度为6~10mmol/L。
[0011]优选地，SPE板在使用前依次采用甲醇和50%（v/v）甲醇水溶液进行活化。
[0012]优选地，所述纯化包括：将所述滤液加入SPE板中，然后依次采用4%~6%甲醇水溶液以及45%~55%甲醇水溶液淋洗SPE板。
[0013]本专利技术进一步发现，选择4%~6%甲醇水溶液以及45%~55%甲醇水溶液作为淋洗液，能够进一步降低血清样本中的杂质干扰，提高SPE板对血清样本的纯化效果，使得加标回收率进一步提升。
[0014]更优选地，所述纯化包括：将所述滤液加入SPE板中，然后依次采用4.5%~5.5%甲醇水溶液以及48%~52%甲醇水溶液淋洗SPE板。
[0015]优选地，所述纯化还包括：在淋洗SPE板之后，采用甲醇洗脱，收集洗脱液，制得纯化样本。
[0016]优选地，采用350~450μL甲醇洗脱。
[0017]本专利技术进一步发现，在本专利技术的检测方法中，选择350~450μL甲醇洗脱时能够使得洗脱效果较好且减少后续氮吹时间，提高检测效率。
[0018]优选地，所述纯化还包括：收集洗脱液之后，采用氮气吹干所述洗脱液，而后用高效液相色谱法中的流动相复溶，制得纯化样本。
[0019]所述流动相为流动相A和流动相B的混合液。
[0020]优选地，氮气吹干的温度为55~65℃。
[0021]优选地，所述高效液相色谱法采用等度洗脱的方式检测所述纯化样本。
[0022]由于通过SPE板纯化后的血清样本中的杂质干扰较少，采用等度洗脱的方式即可实现血清中25
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羟基维生素D2和25
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羟基维生素D3的高灵敏度、高准确性、高重复性的检测效果。
[0023]优选地，等度洗脱的流动相包括：流动相A和流动相B；流动相A为乙酸水溶液，流动相B包括体积比为15~20:1:1的甲醇、异丙醇和异丁醇。
[0024]优选地，流动相B中还包含乙酸。
[0025]优选地，流动相A和流动相B的体积比为1:2.5~3.5。
[0026]本专利技术进一步对流动相的试剂组合以及体积比例进行优化，发现采用上述流动相以及体积比进行等度洗脱时，分离效果进一步提升。
[0027]在具体实施过程中，将校准品、质控品与样本进行一样的前处理。
[0028]在具体实施过程中，过滤沉淀液时可采用正压装置施加压力辅助。
[0029]在具体实施过程中，SPE板活化时可采用正压装置施加压力辅助。
[0030]在具体实施过程中，采用SPE板纯化所述滤液时可采用正压装置施加压力辅助。
[0031]在具体实施过程中，采用正压装置施加压力辅助甲醇洗脱。
[0032]优选地，控制采用正压装置时的流速为2s一滴。
[0033]优选地，控制采用正压装置时的压力为0.01~0.05 Mpa。
[0034]优选地，高效液相色谱检测中选择酝博C18 5μm 4.6
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100mm色谱柱的检测效果更佳。
[0035]本领域技术人员可以进一步通过对上述优选方案进行组合，以得到本专利技术检测方法的其它较优实施方案。
[0036]与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：本专利技术首先解决了采用SPE板前处理血清样本时容易发生堵孔的问题，本专利技术的前处理方法高效、去除杂质能力强、氮吹时间短。进一步，通过SPE板前处理血清样本结合等度洗脱的高效液相色谱法实现了对血清中25
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羟基维生素D2和25
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羟基维生素D3的高灵敏
度、高准确性检测，线性范围、重复性、稳定性、特异性等均满足相关要求。
附图说明
[0037]图1是不同淋洗液组合的前处理效果图。
[0038]图2是对比例1蛋白沉淀板的照片。
[0039]图3是对比例2蛋白沉淀板的照片。
[0040]图4是实施例1蛋白沉淀板的照片。
[0041]图5是对比例3蛋白沉淀板的照片。
具体实施方式
[0042]为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本专利技术中的技术方案进行清楚、完整地描本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种血清中25
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羟基维生素D的检测方法，其特征在于，包括：将样本与硫酸锌、甲醇和乙腈混合制得沉淀液，过滤所述沉淀液制得滤液，采用SPE板纯化所述滤液，制得纯化样本；然后采用高效液相色谱法检测所述纯化样本。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，甲醇和乙腈的体积比为1：（0.8~1.2）。3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，以样本、硫酸锌、甲醇和乙腈的总体积计，硫酸锌的浓度为6~10mmol/L。4.根据权利要求1~3中任一项所述的检测方法，其特征在于，SPE板在使用前依次采用甲醇和甲醇水溶液进行活化。5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述纯化包括：将所述滤液加入SPE板中，然后依次采用4%~6%甲醇水溶液以及45%~55%...

【专利技术属性】
技术研发人员：李小侠，张新星，栗琳，秦于杰，周立，丁亮，王倩倩，应洪波，
申请(专利权)人：湖南豪思生物科技有限公司武汉豪思医学检验实验室有限公司江苏豪思生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：