用于尿路上皮癌基因甲基化检测的核酸产品、试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术提供了用于尿路上皮癌基因甲基化检测的核酸产品、试剂盒及应用。本发明专利技术结合甲基化修饰分析手段，揭示了适于检测尿路上皮癌的靶标区段以及相应的扩增引物，也对探针进行了优化。同时，本发明专利技术也提供了适于添加到PCR体系中以提高检测准确性的甲基化敏感限制性内切酶，适当的内切酶呈现出令人意外的增效作用。用。

【技术实现步骤摘要】
用于尿路上皮癌基因甲基化检测的核酸产品、试剂盒及应用


[0001]本专利技术属于分子生物学领域，特别是涉及一种用于尿路上皮癌基因甲基化检测的核酸产品、试剂盒及应用。

技术介绍

[0002]尿路上皮癌是世界范围内常见的恶性肿瘤，根据肿瘤部位主要包括膀胱癌(约占90％)、输尿管癌和肾盂癌(约占5％
‑
10％)，其发病率及死亡率均占男性泌尿生殖系统肿瘤首位，且呈逐年上升的趋势。早期发现，早治疗对尿路上皮癌患者的预后有着十分重要的意义。
[0003]目前的临床诊断中，尿路上皮癌的检测主要通过膀胱镜、尿路脱落细胞及影像学(如彩色多普勒超声、电子计算机断层扫描(ct)、核磁共振成像(nmri)的检测方式。其中，膀胱镜被作为金标准检测手段，但其检测有创痛苦，患者依从性差且价格不菲，每位患者的检查过程长、效率低，难以推广和覆盖到相对大的群体(例如疾病普查时针对的群体)。而超声检查的灵敏度相对较低，患者需要储存尿液后实施检查，过程繁琐。因此，临床仍需要更好的技术来满足尿路上皮癌的早期诊断和密切的病情监测。
[0004]随着测序技术、芯片技术等的不断发展，技术人员致力于发现尿路上皮癌的分子标志物，例如位于染色体8P和9P的突变、成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)等被作为可选择的分子标志物。随着蛋白质技术的发展，技术人员也开发出了一系列尿肽，作为分子标记物。此外，miRNA也被认为参与了尿路上皮癌的发生发展，人们试图分析血液中或尿液中miRNA来甄别癌症。但是，由于特异性、准确性等限制因素的存在，上述一系列的方法仍然没有从根本上改变临床诊断现状，仍然高度依托于膀胱镜这类有创的诊断方式。
[0005]而技术的进一步发展中，DNA甲基化分析也被技术人员所提出。尽管本领域中以及专利技术人的在先研究中，报道了一些甲基化水平异常的基因区及其检测，但是本领域仍然需要操作简单、具有较好的灵敏度及准确性、贴合临床规模化诊断需求且结果易于判读的检测方法。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种用于尿路上皮癌基因甲基化检测的核酸产品、试剂盒及应用。
[0007]在本专利技术的第一方面，提供检测试剂在制备检测尿路上皮癌的试剂或试剂盒中的用途；其中，所述检测试剂为PCR引物和探针，靶向扩增SEQ ID NO:14所示核苷酸序列的核酸或其片段。
[0008]在一种或多种实施方式中，所述检测试剂所针对的待测样本为尿液样本。
[0009]在一种或多种实施方式中，所述尿路上皮癌包括：膀胱癌，输尿管癌，肾盂癌。
[0010]在一种或多种实施方式中，所述检测试剂还包括甲基化敏感性限制性内切酶，包括选自下组的酶或酶组合：HhaI，BmgBI，HaeII，RruI，TaiI。
[0011]在一种或多种实施方式中，所述酶组合为HhaI和BmgBI。
[0012]在一种或多种实施方式中，所述HhaI和BmgBI的酶组合中，按照体积HhaI:BmgBI用量为1
‑
3:1，较佳地1.5
‑
2.5:1(如1.8
‑
2.2:1)。
[0013]在一种或多种实施方式中，在使用时，所述甲基化敏感性限制性内切酶被添加于PCR反应体系中。
[0014]在一种或多种实施方式中，所述PCR引物扩增SEQ ID NO:14所示核苷酸序列中第33
‑
165位的核酸片段；更佳地，所述引物为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的引物。
[0015]在一种或多种实施方式中，所述探针靶向于SEQ ID NO:14所示核苷酸序列中第76
‑
99位的核酸区段；较佳地，所述探针为SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的探针。
[0016]在一种或多种实施方式中，所述检测试剂还包括：靶向扩增和检测内参基因的PCR引物和探针。
[0017]在一种或多种实施方式中，所述内参基因包括：内参G1和酶切内参G2。
[0018]在一种或多种实施方式中，扩增内参G1的引物为SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的引物；探针为SEQ ID NO:10所示核苷酸序列的探针。
[0019]在一种或多种实施方式中，扩增酶切内参G2的引物为SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示核苷酸序列的引物；探针为SEQ ID NO:13所示核苷酸序列的探针。
[0020]在一种或多种实施方式中，在用于PCR反应时，PCR体系中所述检测试剂具有下组的浓度：
[0021]SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的引物：100
±
30nM(例如100
±
20nM，100
±
10nM，100
±
5nM)，较佳地100
±
10nM；
[0022]SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的引物：100
±
30nM(例如100
±
20nM，100
±
10nM，100
±
5nM)，较佳地100
±
10nM；
[0023]SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的探针：75
±
30nM(例如75
±
20nM，75
±
10nM，75
±
5nM)，较佳地75
±
10nM；
[0024]SEQ ID NO:8所示核苷酸序列的引物：150
±
30nM(例如150
±
20nM，150
±
10nM，150
±
5nM)，较佳地150
±
10nM；
[0025]SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的引物：150
±
30nM(例如150
±
20nM，150
±
10nM，150
±
5nM)，较佳地150
±
10nM；
[0026]SEQ ID NO:10所示核苷酸序列的探针：125
±
30nM(例如125
±
20nM，125
±
10nM，125
±
5nM)，较佳地125
±
10nM；
[0027]SEQ ID NO:11所示核苷酸序列的引物：150
±
30nM(例如150
±
20nM，150
±
10nM，150
±
5nM)，较佳地150
±
10nM；
[0028]SEQ ID NO:12所示核苷酸序列的引物：150
±
30nM(例如150
±
20nM，150
±
10nM，150
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测试剂在制备检测尿路上皮癌的试剂或试剂盒中的用途；其中，所述检测试剂为PCR引物和探针，靶向扩增SEQ ID NO:14所示核苷酸序列的核酸或其片段。2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述检测试剂所针对的待测样本为尿液样本；或所述尿路上皮癌包括：膀胱癌，输尿管癌，肾盂癌。3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述检测试剂还包括甲基化敏感性限制性内切酶，包括选自下组的酶或酶组合：HhaI，BmgBI，HaeII，RruI，TaiI；较佳地，所述酶组合为HhaI和BmgBI；更佳地，所述HhaI和BmgBI的酶组合中，按照体积HhaI:BmgBI用量为1
‑
3:1，较佳地1.5
‑
2.5:1；较佳地，在使用时，所述甲基化敏感性限制性内切酶被添加于PCR反应体系中。4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述PCR引物扩增SEQ ID NO:14所示核苷酸序列中第33
‑
165位的核酸片段；更佳地，所述引物为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的引物；所述探针靶向于SEQ ID NO:14所示核苷酸序列中第76
‑
99位的核酸区段；较佳地，所述探针为SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的探针。5.如权利要求1～4任一所述的用途，其特征在于，所述检测试剂还包括：靶向扩增和检测内参基因的PCR引物和探针；较佳地，所述内参基因包括：内参G1和酶切内参G2；较佳地，扩增内参G1的引物为SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的引物；探针为SEQ ID NO:10所示核苷酸序列的探针；较佳地，扩增酶切内参G2的引物为SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示核苷酸序列的引物；探针为SEQ ID NO:13所示核苷酸序列的探针。6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，在用于PCR反应时，PCR体系中所述检测试剂具有下组的浓度：SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的引物：100
±
30nM，较佳地100
±
10nM；SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的引物：100
±
30nM，较佳地100
±
10nM；SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的探针：75
±
30nM，较佳地75
±
10nM；SEQ ID NO:8所示核苷酸序列的引物：150
±
30nM，较佳地150
±
10nM；SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的引物：150
±
30nM，较佳地150
±
10nM；SEQ ID NO:10所示核苷酸序列的探针：125
±
30nM，较佳地125
±
10nM；SEQ ID NO:11所示核苷酸序列的引物：150
±
30nM，较佳地150
±
10nM；SEQ ID NO:12所示核苷酸序列的引物：150
±
30nM，较佳地150
±
10nM；SEQ ID NO:13所示核苷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：李振艳，
申请(专利权)人：上海奕谱生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：