一种shRNA、慢病毒载体及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提出了一种shRNA、慢病毒载体及其构建方法和应用，所述shRNA的核苷酸序列为：GCAATCAGTTAGCAGACTTGA。慢病毒载体，包括载体质粒，所述载体质粒中包含有上述shRNA序列。本发明专利技术提出了慢病毒对TET1酶的敲低作用及其对于认知记忆功能和Wnt信号通路的影响，筛选出了含有特定序列的慢病毒载体对于小鼠海马区TET1酶的敲低作用，以及TET1酶敲低后对于小鼠空间记忆、行为认知和对Wnt通路等方面的影响。行为认知和对Wnt通路等方面的影响。行为认知和对Wnt通路等方面的影响。

【技术实现步骤摘要】
一种shRNA、慢病毒载体及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于医疗
，具体涉及一种shRNA、慢病毒载体及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]阻塞性睡眠呼吸暂停(OSA)是最常见的睡眠呼吸障碍疾病，以慢性间歇性低氧高碳酸血症和睡眠碎片化为核心病理特征，进而诱导全身炎症反应和氧化应激，最终导致全身多系统并发症尤其是神经认知和行为功能异常，严重影响儿童生长发育和远期生活质量。有研究表明OSA 与氧化应激的增加有关，其引起的活性氧应激与免疫、炎症、神经发生等多种信号通路有密切的联系。
[0003]DNA甲基化及去甲基化修饰参与基因的表达调控，可介导多种生理和病理过程，且二者的动态平衡可以维持遗传表达稳定性，DNA去甲基化酶主要指10
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11易位蛋白（ten
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eleven
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translocation protein，TET）家族，包括TET1、TET2、TET3，是调节DNA 甲基化和去甲基化的重要酶类。 TET 酶是2
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氧代戊二酸依赖性双加氧酶家族成员，对神经系统认知相关功能调控起到了重要作用，其介导的DNA羟甲基化过程的动态调节依赖于血氧和氧代谢。TET1酶可促使5mc氧化为为5
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羟甲基胞嘧啶（5
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hydroxymethylcytosine， 5hmC），5hmc在中枢神经系统中含量丰富，而5hmC水平的失调与精神和神经发育障碍的病因有关。TET酶通过调控神经发育相关基因5hmc水平影响神经系统的正常发育和功能。慢病毒载体(lentiviral victors, LVs)体是一种经过基因改造的病毒载体，在剔除慢病毒致病因子的同时，保留其基因组能整合到宿主基因组的能力，可携带各种外源性基因或改造基因整合至宿主染色体中达到稳定表达的目的。近年来，慢病毒载体在神经科学领域的应用得到了越来越广泛的应用。

技术实现思路

[0004]本专利技术是为了解决上述技术问题，提出了一种shRNA，以及含有该shRNA的慢病毒载体及其构建方法，并通过该慢病毒载体实现了对TET1酶的敲低，进而再小鼠上试验了该慢病毒载体对于阻塞性睡眠呼吸暂停的治疗作用。
[0005]一种shRNA，所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0006]核苷酸序列具体为：GCAATCAGTTAGCAGACTTGA。
[0007]一种慢病毒载体，包括载体质粒，所述载体质粒中包含有上述shRNA序列。
[0008]可选地，所述载体质粒中还包括筛选标记物的编码核苷酸。
[0009]可选地，所述筛选标记物为荧光蛋白。
[0010]可选地，所述载体质粒为慢病毒穿梭质粒LV3。
[0011]本申请还提出了慢病毒载体的构建方法，包括如下步骤：步骤一，构建所述载体质粒；步骤二，将所述载体质粒、慢病毒包装质粒、转染试剂、宿主细胞混合，对宿主细胞
进行转染；步骤三，培养转染后的宿主细胞，得到所述慢病毒载体。
[0012]可选地，所述转染试剂为RNAi
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Mate。
[0013]可选地，所述构建方法还包括：获得所述慢病毒载体后进行筛选，所述筛选包括使用获得的慢病毒载体感染293T细胞，根据荧光蛋白表达情况，筛选出成功感染293T细胞的慢病毒载体。
[0014]可选地，所述构建方法还包括：将所述慢病毒载体感染的293T细胞通过RT
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PCR检测TET1酶在mRNA水平上的表达情况，筛选出成功敲低TET1酶表达的慢病毒载体。
[0015]本申请还提出了一种细胞，所述细胞中包含上述的慢病毒载体。
[0016]本申请还提出了上述的shRNA、慢病毒载体、细胞在敲低TET1酶表达和/或降低Wnt信号通路5
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羟甲基胞嘧啶中的应用。
[0017]本申请还提出了上述shRNA、慢病毒载体、细胞在制备用于治疗阻塞性睡眠呼吸暂停的产品中的应用。所述产品包括药物。
[0018]与现有技术相比，本专利技术具有如下技术效果：1、本专利技术提出了一种shRNA序列，其核苷酸序列为：GCAATCAGTTAGCAGACTTGA，测试结果表明，含有该序列的慢病毒载体对TET1酶具有敲低作用。
[0019]2、本专利技术提出了含有上述shRNA序列的慢病毒对TET1酶的敲低作用及其对于认知记忆功能和Wnt信号通路的影响，筛选出了含有特定序列的慢病毒载体对于小鼠海马区TET1酶的敲低作用，以及TET1酶敲低后对于小鼠空间记忆、行为认知和对Wnt通路的影响等方面的影响，并进行了分子生物学验证。
[0020]3、本专利技术的慢病毒的构建方法通过细胞荧光实验精准地检测并筛选到特定序列慢病毒，用RT
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PCR对筛选结果进行验证。对小鼠海马区注射慢病毒后对其进行行为学实验，结果同间歇性缺氧组小鼠相比，慢病毒注射组小鼠的空间记忆和认知记忆能力有显著改善。
[0021]同时对对照、间歇性缺氧、慢病毒注射干预小鼠海马组织取材进行常规RNA提取,用RT
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PCR对筛选结果进行验证。对小鼠海马区注射慢病毒后对其进行行为学实验，结果同间歇性缺氧组小鼠相比，慢病毒注射组小鼠的空间记忆和认知记忆能力有显著改善，且空载体组同缺氧组在行为学和分子生物学验证上无明显差异。同时对对照、间歇性缺氧、慢病毒注射干预和空载体组小鼠海马组织取材进行常规RNA提取，RT
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PCR进一步验证了TET1酶的敲低作用。并且发现在间歇性缺氧刺激下TSS区的DNA甲基化及羟甲基化变化情况，筛选到与海马神经发生过程密切相关的Wnt信号通路及下游基因Wnt3a、Ccnd2，并进行RT
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PCR验证，结果显示Wnt3a、Ccnd2的5hmC富集水平同间歇性缺氧组较慢病毒注射组显著升高。以上均说明了，一方面，所述的shRNA或含有其的慢病毒载体、细胞可以敲低TET1酶表达和降低Wnt信号通路5
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羟甲基胞嘧啶，另一方面，所述的shRNA或含有其的慢病毒载体、细胞可以用于治疗阻塞性睡眠呼吸暂停，改善或治疗阻塞性睡眠呼吸暂停导致的认知功能损伤，如空间记忆和认知记忆能力的改善和治疗。
附图说明
[0022]图1为包含shRNA的质粒结构图；
图2为慢病毒载体1转染293T细胞荧光；图3为RT
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PCR验证293T细胞，正常组，慢病毒载体组，空白对照组；图4为海马组织TET1酶相对表达量验证；图5为通过巴恩斯迷宫测得的不同组小鼠在训练第5、12天的运动轨迹；图6为通过巴恩斯迷宫测得的不同组小鼠在训练第1~4天识别目标洞的时间（潜伏期）；图7为通过巴恩斯迷宫测得的不同组小鼠在训练第5、12天识别目标洞的时间（潜伏期）；图8为通过Y迷宫测得的不同组小鼠自发交替行为百分比；图9为通过Y迷宫测得的不同组小鼠进入臂次数；图10为5
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. 一种shRNA，其特征在于，所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种慢病毒载体，包括载体质粒，其特征在于，所述载体质粒中包含权利要求1中所述的shRNA。3.根据权利要求2所述的慢病毒载体，其特征在于，所述载体质粒中还包括筛选标记物的编码核苷酸。4.根据权利要求3所述的慢病毒载体，其特征在于，所述筛选标记物为荧光蛋白；优选的，所述载体质粒为慢病毒穿梭质粒LV3。5.权利要求2~4任一项所述的慢病毒载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，构建所述载体质粒；步骤二，将所述载体质粒、慢病毒包装质粒、转染试剂、宿主细胞混合，对宿主细胞进行转染；步骤三，培养转染后的宿主细胞，得到所述慢病毒载体。6.根据权利要求5所述的慢病毒载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括：获得所述慢病毒载体后进行筛选，所述筛...

【专利技术属性】
技术研发人员：邰隽，王珊，孔雅茹，季洁，占小俊，姚海兰，董佳佳，刘一帆，齐雨薇，
申请(专利权)人：首都儿科研究所，
类型：发明
国别省市：