用于清除HBV病毒的基因片段、其工具系统及应用技术方案

本发明专利技术涉及用于清除HBV病毒的基因片段、其工具系统及应用。该基因片段的序列为SEQ ID No.1至SEQ ID No.10之一。根据上述基因片段合成出相应的crRNA，应用于I

【技术实现步骤摘要】
用于清除HBV病毒的基因片段、其工具系统及应用


[0001]本专利技术涉及用于清除HBV病毒的基因片段、其工具系统及应用，属于生物技术、生物医药


技术介绍

[0002]乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)是一种能够引起多种肝脏疾病(包括肝炎，肝纤维化，肝细胞癌)的病毒。在全世界范围内，慢性乙肝感染者有近3.5亿人，而其中近三分之一感染者在我国。乙型肝炎病毒给全世界尤其是我国的医疗卫生体系带来了巨大的挑战。目前针对HBV的治疗方法主要包括两种：1.采用α干扰素(IFN
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α)、聚乙二醇化α干扰素(PEG
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IFN
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α)进行治疗，以干扰素治疗HBV感染的机制目前尚未完全明确，普遍认为可能是通过直接抑制病毒复制或者通过免疫调节作用来实现治疗。2.采用核苷类似物进行治疗，当前临床使用的核苷类似物主要包括拉米夫定，阿德福韦酯，恩替卡韦，替诺夫韦，替比夫定等；这些药物主要作用于乙肝病毒的逆转录酶，通过抑制病毒的逆转录从而抑制病毒的复制。但是，当前的这些药物都只能抑制病毒的复制，并不能直接清除已经存在的病毒基因组DNA，复发率高，且需要长期用药。因此，当前迫切需要研制出能够清除HBV基因组DNA从而实现功能性治愈效果的技术手段。
[0003]目前已经有技术方案利用CRISPR
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Cas9基因编辑系统通过切割双链DNA造成碱基的插入或缺失(InDel)来沉默基因表达(例如授权公告号CN106754912B的专利技术专利)，然而此类技术方案并不能实现DNA长片段的清除，对于HBV病毒库cccDNA的清除效率仍然较低。根据文献1记载的内容可知，如图1所示，CRISPR
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Cas9系统对乙肝病毒抗原和病毒DNA拷贝数的降低幅度不足50％，清除病毒的效果非常有限；根据文献2记载的内容可知，如图2所示，在动物实验中CRISPR
‑
Cas9系统也有类似效果，只能部分降低病毒载量，无法实现彻底的清除。
[0004]文献1：Jie Wang,et al.Dual gRNAs guided CRISPR/Cas9 systeminhibits hepatitis B virus replication.World Journal of Gastroenterol,2015,21(32):9554
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9565.
[0005]文献2：Daniel Stone,et al.CRISPR
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Cas9 gene editing of hepatitis B virus in chronically infected humanized mice.Molecular Therapy:Methods&Clinical Development,2021,20:258
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275.
[0006]本专利技术的专利技术人课题组于2022年9月19日申请的专利技术专利《一种I
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B型CRISPR
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Cascade
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Cas3基因编辑系统及应用》中，公开了I
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B型CRISPR
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Cascade
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Cas3基因编辑系统，能够使单个CRISPR靶向位点形成不同程度的长片段缺失，从而弥补CRISPR
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Cas9产生长片段缺失的能力相对有限的空白。目前经进一步研究得出了该I
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B型CRISPR
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Cascade
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Cas3基因编辑系统用于清除HBV病毒的应用成果，并以此来申报本专利技术专利。

技术实现思路

[0007]本专利技术的主要目的是：克服现有技术存在的问题，提供一种用于清除HBV病毒的基因片段，将其对应的crRNA与I
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B型CRISPR
‑
Cascade
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Cas3基因编辑系统相配合后，能够有效清除HBV病毒DNA；同时还提供含有该基因片段的工具系统，以及相关应用。
[0008]本专利技术解决其技术问题的技术方案如下：
[0009]用于清除HBV病毒的基因片段，其特征是，所述基因片段与crRNA相对应；所述基因片段的基本结构为5'
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tgagcac
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子片段
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gtgtccaaaccattgatgccgtaag gcgt
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3'；所述基因片段的序列为SEQ ID No.1至SEQ ID No.10之一。
[0010]优选地，所述基因片段的序列为SEQ ID No.5。
[0011]根据上述基因片段可合成出相应的crRNA，用于清除HBV病毒。
[0012]本专利技术还提供：
[0013]与前文所述基因片段对应的crRNA。
[0014]优选地，所述crRNA的3'端和5'端各有3个碱基进行了硫代修饰和甲氧基修饰。
[0015]上述crRNA与I
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B型CRISPR
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Cascade
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Cas3基因编辑系统相配合后，能够对HBV感染的病毒库cccDNA进行清除，实现HBV病毒特异的长片段清除，在乙肝病毒感染的临床治愈上具有巨大潜力。
[0016]本专利技术还提供：
[0017]一种工具系统，其特征是，所述工具系统含有前文所述的crRNA；所述工具系统为Cas3基因编辑系统。
[0018]优选地，所述Cas3基因编辑系统为I
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B型CRISPR
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Cascade
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Cas3基因编辑系统。
[0019]优选地，所述I
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B型CRISPR
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Cascade
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Cas3基因编辑系统由Cascade复合物以及Cas3蛋白组成；所述crRNA位于Cascade复合物中；所述Cascade复合物由Cmx8蛋白、Cas8蛋白、Cas5蛋白、Cas6蛋白、Cas11蛋白以及crRNA复合而成；所述Cmx8蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.11；所述Cas8蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.12；所述Cas5蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.13；所述Cas6蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.14；所述Cas11蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.15；所述Cas3蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.16。
[0020]上述工具系统能够有效清除乙肝病毒。
[0021]本专利技术还提供：
[0022]前文所述基因片段、或前文所述crRNA、或前文所述工具系统用于制备清除HBV病毒的产品的应用。
[0023]优选地，所述产品为治疗乙肝的药物。
[0024]含有前文所述工具系统的细胞系或细胞株。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于清除HBV病毒的基因片段，其特征是，所述基因片段与crRNA相对应；所述基因片段的基本结构为5'
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tgagcac
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子片段
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gtgtccaaaccattgatgccgta aggcgt
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3'；所述基因片段的序列为SEQ ID No.1至SEQ ID No.10之一。2.根据权利要求1所述的基因片段，其特征是，所述基因片段的序列为SEQ ID No.5。3.与权利要求1或2所述的基因片段对应的crRNA。4.根据权利要求3所述的crRNA，其特征是，所述crRNA的3'端和5'端各有3个碱基进行了硫代修饰和甲氧基修饰。5.一种工具系统，其特征是，所述工具系统含有权利要求3或4所述的crRNA；所述工具系统为Cas3基因编辑系统。6.根据权利要求5所述的工具系统，其特征是，所述Cas3基因编辑系统为I
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B型CRISPR
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Cascade
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Cas3基因编辑系统。7.根据权利要求6所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨振煌，肖易倍，
申请(专利权)人：深圳市艾迪贝克生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：