一种猕猴桃环斑病毒的多克隆抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种猕猴桃环斑病毒的多克隆抗体及其制备方法和应用，该猕猴桃环斑病毒的多克隆抗体的制备方法包括：采用原核表达系统，构建AcCRaV

【技术实现步骤摘要】
一种猕猴桃环斑病毒的多克隆抗体及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种猕猴桃环斑病毒的多克隆抗体及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]猕猴桃是营养丰富的经济类水果，因其果肉含有丰富的维生素C、矿物质及膳食纤维，深受大众的青睐，对人类健康有很大的益处。病毒是感染猕猴桃的重要微生物病原，降低猕猴桃产量、品质和经济效益，严重威胁猕猴桃产业的发展。猕猴桃褪绿环斑病毒(Actinidiachloroticringspot
‑
associatedvirus，AcCRaV)是一种特异性侵染猕猴桃的病毒，该病毒在猕猴桃产区普遍发生，且通常和其它病毒复合侵染。猕猴桃在感染AcCRaV时，常表现出叶片褪绿、斑驳和环斑等症状，严重影响猕猴桃的产量和品质。
[0003]目前关于AcCRaV的主要检测方式是利用病毒的特异性引物，进行逆转录聚合酶链反应(RT
‑
PCR)。这种方法通常具有较高的灵敏度，但存在耗时费力、仪器设备要求高、技术过于专业，田间难以操作的缺点。

技术实现思路

[0004]为了解决现有技术存在的上述不足，本专利技术的目的是提供一种猕猴桃环斑病毒的多克隆抗体及其制备方法和应用，采用该多克隆抗体作为检测试剂应用于猕猴桃环斑病毒的准确、快速检测。
[0005]本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：
[0006]一种猕猴桃环斑病毒的多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
[0007](1)以感染猕猴桃环斑病毒猕猴桃的总RNA为模板制备模板DNA；
[0008](2)以步骤(1)制得的模板DNA为模板，采用AcCRaV
‑
BamH I
‑
F/Xho I
‑
R引物继续PCR扩增出AcCRaV
‑
CP目标基因片段；
[0009](3)将AcCRaV
‑
CP目标基因片段连接到表达载体上，获得重组载体，然后将重组载体转染大肠杆菌，诱导蛋白表达和纯化，得到重组蛋白；
[0010](4)以步骤(3)制得的重组蛋白，制备获得猕猴桃环斑病毒的多克隆抗体。
[0011]进一步地，步骤(1)具体过程为：以感染猕猴桃环斑病毒猕猴桃的总R NA为模板，反转录制备cDNA，采用AcCRaV
‑
CP
‑
F
‑
933/AcCRaV
‑
CP
‑
R
‑
933引物进行PCR扩增，并对扩增产物进行密码子优化，制得模板DNA。
[0012]进一步地，AcCRaV
‑
CP
‑
F
‑
933序列为：5
’‑
TTAAGTAGAAGAACCACA ATAT
‑3’
，AcCRaV
‑
CP
‑
R
‑
933序列为：5
’‑
ATGCCAAAGCCTATGCAAG
‑3’
。
[0013]进一步地，步骤(1)PCR扩增条件为：
[0014]扩增体系包括：1μL cDNA，1μL AcCRaV
‑
CP
‑
F
‑
933，1μL AcCRaV
‑
CP
‑
R
‑
933，12.5μL 2
×
Taq Master Mix，9.5μL ddH2O；
[0015]扩增程序为：预变性94℃3min，变性94℃30s，退火54℃30s，延伸72℃1min，34个循
环，终止延伸72℃10min，12℃保存。
[0016]进一步地，步骤(2)AcCRaV
‑
BamH I
‑
F序列为：5
’‑
CGGGATCCATG CCGAAGCCCATGCAGG
‑3’
，AcCRaV
‑
Xho I
‑
R序列为：5
’‑
CCCTCGAGGG TCGACGAGCCGCAATACTT
‑3’
。
[0017]进一步地，步骤(2)PCR扩增条件为：
[0018]扩增体系包括：2μL模板DNA，2μL AcCRaV
‑
BamH I
‑
F，2μL AcCRa V
‑
Xho I
‑
R，25μL 2
×
High
‑
Fidelity Master Mix，19μL ddH2O；
[0019]扩增程序为：预变性94℃3min，变性94℃30s，退火62℃30s，延伸72℃1min，34个循环，终止延伸72℃10min，12℃保存。
[0020]上述方法制备得到的猕猴桃环斑病毒的多克隆抗体。
[0021]上述制得的猕猴桃环斑病毒的多克隆抗体在猕猴桃环斑病毒检测中的应用。
[0022]一种猕猴桃环斑病毒检测试剂、检测试剂盒或检测试纸，包括上述方法制得的猕猴桃环斑病毒的多克隆抗体。
[0023]本专利技术具有以下有益效果：
[0024](1)本专利技术使用原核表达系统表达纯化的AcCRaV外壳蛋白作为抗原，制备出AcCRaV
‑
CP多克隆抗体，抗体效价高达1:1024000，表明本专利技术的多克隆抗体灵敏度高、特异性好、稳定性强，为建立快速、准确、简便、经济的AcCRaV检测技术提供了实验依据。
[0025](2)猕猴桃病毒的抗体制备仅有少量研究，目前没有针对的多克隆抗体制备研究。项目研发了针对AcCRaV的多克隆抗体，具有材料和技术的创新性和先进性，填补了猕猴桃AcCRaV病毒检测中多克隆抗体制备技术的空白。
[0026](3)本专利技术根据AcCRaV基因组特点，采用特有的密码子优化方法，调整密码子适应指数CAI(Codon Adaption Index)值为0.98，此数值越接近1，外源蛋白在宿主细胞中的蛋白表达越高；并调整GC含量为57％，从而避免过高的GC含量影响表达效率，进行密码子优化后，显著提高了AcCRaV外壳蛋白的可溶性表达。
[0027](4)AcCRaV基因组比普通病毒更庞大，变异较多，本项目在众多变异位点之间选择了相对保守的外壳蛋白基因的核心区段，保证了抗体的通用性。
附图说明
[0028]图1为AcCRaV
‑
CP目的基因扩增电泳图；
[0029]图2为AcCRaV
‑
CP序列扩增结果比对；
[0030]图3为AcCRaV
‑
CP密码子优化适应指数；
[0031]图4为AcCRaV
‑
CP密码子优化GC含量调整结果；
[003本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猕猴桃环斑病毒的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以感染猕猴桃环斑病毒猕猴桃的总RNA制备模板DNA；(2)以步骤(1)制得的模板DNA为模板，采用AcCRaV
‑
BamH I
‑
F/Xho I
‑
R引物进行PCR扩增，扩增出AcCRaV
‑
CP目标基因片段；(3)将AcCRaV
‑
CP目标基因片段连接到表达载体上，获得重组载体，然后将重组载体转染大肠杆菌，诱导蛋白表达和纯化，得到重组蛋白；(4)以步骤(3)制得的重组蛋白，制备获得猕猴桃环斑病毒的多克隆抗体。2.根据权利要求1所述的猕猴桃环斑病毒的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(1)具体过程为：以感染猕猴桃环斑病毒猕猴桃的总RNA为模板，反转录制备cDNA，采用AcCRaV
‑
CP
‑
F
‑
933/AcCRaV
‑
CP
‑
R
‑
933引物进行PCR扩增，并对扩增产物进行密码子优化，制得模板DNA；所述AcCRaV
‑
CP
‑
F
‑
933序列为：5
’‑
TTAAGTAGAAGAACCACAATAT
‑3’
，所述AcCRaV
‑
CP
‑
R
‑
933序列为：5
’‑
ATGCCAAAGCCTATGCAAG
‑3’
。3.根据权利要求2所述的猕猴桃环斑病毒的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述PCR扩增条件为：扩增体系包括：1μL cDNA，1μL AcCRaV
‑
CP
‑
F
‑
933，1μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：尚静，冯鸿萍，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：