一种广谱识别人源诺如病毒的可溶性单链抗体及制备方法技术

本发明专利技术公开了一种广谱识别人源诺如病毒的可溶性单链抗体及制备方法，涉及生物技术领域，可溶性单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；其制备方法包括：获得广谱识别hNoV的可溶性单链抗体J5D核苷酸序列；构建重组原核表达质粒pMAL

【技术实现步骤摘要】
一种广谱识别人源诺如病毒的可溶性单链抗体及制备方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种广谱识别人源诺如病毒的可溶性单链抗体及制备方法。

技术介绍

[0002]目前，人源诺如病毒(human norovirus，hNoV)的检测方法主要有：基于病毒核酸片段的分子检测法和检测抗原决定簇的免疫学方法。
[0003]分子检测法主要包括：RT
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PCR和RT
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qPCR。其中，因RT
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qPCR方法敏感性和特异性高，成为了该病毒检测的“金标准”。然而，hNoV基因型多样且易发生突变，没有通用的检测体系；且此方法通常需要精密的设备和专业的操作人员，检测周期约2h，使用场景严重受限。
[0004]免疫学方法是通过检测病毒抗原，诊断是否感(污)染hNoV；主要衣壳蛋白是该病毒的主要免疫原性蛋白，可分为高度保守的壳区和易发生变异的突出区。以突出区作为检测靶标，仅可检测个别基因型hNoV；以保守区为检测靶标，可以广谱性检测hNoV。但是，免疫学检测所用到的单克隆抗体制备流程复杂、对技术员要求苛刻、生产成本高，且杂交瘤细胞易退化。
[0005]抗体是效应B细胞产生的一类能识别抗原并与其特异性结合的免疫球蛋白，经典的抗体是由两条重链和轻链组成的“Y”型结构，重链和轻链都包括可变区和恒定区。单链抗体(single chain fragment variable，scFv)是一种基因工程抗体，是通过一条连接肽(linker)将重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)连接起来的多肽链。Linker序列应具有一定的亲水性且不应太短，减少多肽链的聚集，保证在蛋白质折叠过程中linker不会影响VH和VL所形成的空间结构。其中，连接肽(Gly4Ser)3的柔韧性好、免疫原性低，已成为目前应用最广泛的linker。
[0006]大肠杆菌培养成本低、生长速度快、候选克隆载体和宿主菌株数量多，已成为生产scFv最常见的宿主。在大肠杆菌细胞质的还原环境中大量表达时，scFv容易形成不溶性聚集体(包涵体)，无生物学活性。为了保障scFv的识别活性，可利用信号肽将scFv引导至大肠杆菌的周质空间中提高可溶性表达，但表达量太低。另外，添加促溶标签蛋白是表达可溶性单链抗体的常用方法之一，常用的促溶标签蛋白有麦芽糖结合蛋白(Maltose binding protein，MBP)、谷胱甘肽巯基转移酶(Glutathione S
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transferase，GST)和小泛素样修饰蛋白(small ubiquitin
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related modifier，SUMO)等。
[0007]因此，本领域的技术人员致力于开发一种低成本、可溶且特异性识别并结合抗原的可广谱性识别不同基因型hNoV的scFv。

技术实现思路

[0008]有鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是如何制备一种低成本、可溶且特异性识别并结合抗原的可广谱性识别不同基因型hNoV的scFv。
[0009]为实现上述目的，本专利技术提供了一种可溶性单链抗体J5D，氨基酸序列如SEQ IDNo.3所示。
[0010]本专利技术还提供了一种可溶性单链抗体J5D的制备方法，包括以下步骤：
[0011]步骤1、获得广谱识别不同基因型hNoV的可溶性单链抗体J5D核苷酸序列；
[0012]步骤2、以步骤1得到的J5D基因编码序列为模板，构建重组原核表达质粒pMAL
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c5X
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J5D；
[0013]步骤3、培养含步骤2得到的重组原核表达质粒pMAL
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c5X
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J5D的重组菌，进行J5D的原核表达和纯化。
[0014]进一步地，步骤1还包括以下步骤：
[0015]步骤1.1、设计鼠源单克隆抗体可变区引物；
[0016]步骤1.2、培养杂交瘤细胞，提取mRNA，以反转录获得的cDNA为模板，利用步骤1.1得到的鼠源单克隆抗体可变区引物扩增J5D的VH和VL基因片段；
[0017]步骤1.3、分别以含步骤1.2得到的J5D的VH和VL基因序列的T载体为模板，以5H
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F和5H
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R
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Linker为引物扩增J5D
‑
VH
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Linker核苷酸片段，以Linker
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5K
‑
F和5K
‑
R为引物扩增Linker
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J5D
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VL核苷酸片段，利用SOE
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PCR将其拼接，得到J5D基因。
[0018]进一步地，步骤2还包括提取重组原核表达质粒pMAL
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c5X
‑
J5D，化学法转化Origami2感受态细胞，阳性克隆保存备用。
[0019]进一步地，步骤3还包括以下步骤：取含重组原核表达质粒pMAL
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c5X
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J5D的Origami2大肠杆菌菌液在含氨苄青霉素的LB固体培养基上划线，培养；挑单克隆于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，振荡培养；扩大培养，当OD
600
为0.6左右时，取3mL未诱导菌液，离心后弃第一上清，将第一沉淀于
‑
20℃保存；向剩余菌液中加入IPTG，振荡培养，取菌液，离心后弃第二上清，将第二沉淀于
‑
20℃保存；剩余诱导后的菌液离心，弃上清，收集菌体，加入Lysis buffer重悬，使用超声波细胞粉碎机破碎菌体将蛋白释放，分别收集可能含有可溶性蛋白的上清和可能含有不溶性蛋白的沉淀；第一沉淀为未诱导菌体、第二沉淀为诱导后菌体、可能含有可溶性蛋白的上清为诱导菌体破碎后上清、可能含有不溶性蛋白的沉淀为诱导菌体破碎后沉淀，将未诱导菌体、诱导后菌体、诱导菌体破碎后上清、诱导菌体破碎后沉淀利用SDS
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PAGE鉴定J5D蛋白是否成功诱导表达，以及是否为可溶性表达。
[0020]本专利技术还提供了一种重组原核表达质粒pMAL
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c5X
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J5D，氨基酸序列如SEQ IDNo.4所示。
[0021]进一步地，重组原核表达质粒pMAL
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c5X
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J5D带MBP标签。
[0022]进一步地，MBP标签具有促溶活性，能够辅助提高scFv的生物学活性。
[0023]本专利技术还提供了一种重组原核表达质粒pMAL
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c5X
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J5D的构建方法，包括以下步骤：
[0024]步骤1)以J5D基因编码序列为模板，利用上游引物和下游引物，通过PCR扩增获得含Nde I和Hind III酶切位点的J5D编码基因片段，用琼脂糖凝胶纯化试剂盒将其回收，得到J5D编码基因回收产物；
[00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可溶性单链抗体J5D，其特征在于，所述可溶性单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。2.如权利要求7所述的可溶性单链抗体J5D的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤1、获得广谱识别不同基因型hNoV的可溶性单链抗体J5D核苷酸序列；步骤2、以步骤1得到的J5D基因编码序列为模板，构建重组原核表达质粒pMAL
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c5X
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J5D；步骤3、将取含步骤2得到的重组原核表达质粒pMAL
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c5X
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J5D培养，进行J5D的原核表达和纯化。3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1还包括以下步骤：步骤1.1、设计鼠源单克隆抗体可变区引物；步骤1.2、培养杂交瘤细胞，提取mRNA，以反转录获得的cDNA为模板，利用步骤1.1得到的鼠源单克隆抗体可变区引物扩增J5D的VH和VL基因片段；步骤1.3、分别以含步骤1.2得到的J5D的VH和VL基因序列的T载体为模板，以5H
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F和5H
‑
R
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Linker为引物扩增J5D
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VH
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Linker核苷酸片段，以Linker
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5K
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F和5K
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R为引物扩增Linker
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J5D
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VL核苷酸片段，利用SOE
‑
PCR将其拼接，得到J5D基因。4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2还包括提取所述重组原核表达质粒pMAL
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c5X
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J5D，化学法转化Origami2感受态细胞，阳性克隆保存备用。5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3还包括以下步骤：取含所述重组原核表达质粒pMAL
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c5X
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J5D的Origami2大肠杆菌菌液在含氨苄青霉素的LB固体培养基上划线，培养；挑单克隆于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，振荡培养；扩大培养，当OD
600
为0.6左右时，取3mL未诱导菌液，离心后弃第一上清，将第一沉淀于
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20℃保存；向剩余菌液中加入IPTG诱导，振荡培养，取菌液，离心后弃第二上清，将第二沉淀于
‑
20℃保存；剩余诱导后的菌液离心，弃上清，收集菌体，加入Lysis buffer重悬，使用超...

【专利技术属性】
技术研发人员：王大鹏，王凤青，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：