一种用于肉类掺假鉴别的组合物及含其试剂盒与应用制造技术

本发明专利技术属于基因检测技术领域，具体涉及一种用于肉类掺假鉴别的组合物及含其试剂盒与应用。本发明专利技术提供了一种用于肉类掺假鉴别的组合物，所述组合物包括第一核酸组合物、第二核酸组合物和荧光探针组。所述第一核酸组合物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1

【技术实现步骤摘要】
一种用于肉类掺假鉴别的组合物及含其试剂盒与应用


[0001]本专利技术属于基因检测
，具体涉及一种用于肉类掺假鉴别的组合物及含其试剂盒与应用。

技术介绍

[0002]细胞色素b(cytb)基因是目前最常用的种属特异性基因之一，编码线粒体内膜上细胞色素b氧化酶的基因的一个亚基，由mtDNA的H链所编码。该基因的编码序列区域进化缓慢，相对保守，但是保守区中的可变区域进化快，不同种属间差异大，故可根据其序列差异来进行种属的区分。多数相关研究已经表明在物种鉴定中可将cytb基因检测作为一种重要的手段。
[0003]肉类掺假鉴别方法有基于感官、物理技术、光谱技术、免疫学技术、DNA分析等检测方法。其中，以依靠感官与经验的传统的肉类形态学为主的鉴别手段，无法准确鉴别加工处理后的肉类制品。基于光谱法的鉴别方法，如拉曼光谱技术，红外光谱法，借助肉类中氨基酸、酚类和糖类等代谢物含量和构成进行鉴别，仪器价格高昂，较难普及。基于免疫学的鉴别方法，如酶联免疫吸附试验，利用抗原抗体相互作用来检测种属特异性蛋白质，因蛋白质易被高温破坏，稳定性较差，灵敏度和特异性较低。
[0004]DNA分子存在于所有组织，具有高温热稳定性，DNA分析方法通过分析线粒体或者核DNA序列在物种间的差异进行检测，具有高灵敏度和高特异性，是肉类掺假鉴别的核心方法。在肉类实际鉴定过程中，PCR应用最为广泛，检测灵敏度较高、结果重复性好等优势，但实验程序较复杂，操作繁琐耗时。实时荧光定量PCR(RT
‑
PCR)可分为染料法和探针法，其中探针法通过模板与探针结合和水解使特异性更强，而且不需要进行电泳，简化了流程，可实现单个反应将多种肉类同时进行鉴定的目的。无论是PCR还是RT
‑
PCR，其均是基于PCR的检测方法，其灵敏度和特异性也较局限，对于样本中痕量的靶标基因很可能造成误检。
[0005]LAMP技术是一种高特异性、高灵敏度的恒温扩增手段。而多重LAMP体系可在单体系内实现对多个靶标的检测，但由于LAMP体系所用DNA聚合酶缺失5
’‑3’
核酸外切酶活性，无法水解探针而释放荧光，使多重LAMP扩增的定量及实时检测的实现出现了一定技术瓶颈。因此现有研究报道所建立的基于荧光探针的多重LAMP体系，主要是通过链置换激活，但特异性仍然不足。并且该技术并不能对序列高度相似的SNP进行区分，例如，中国专利申请201180040896.0公开了一种能够快速区分所选择病原体的所选择株与相同种内其它种群的基于基因的诊断法，可以通过使用寡核苷酸探针，称为“同化探针”，来完成DNA的LAMP的序列特异性实时监测，所述同化探针包含两条寡核苷酸链，其中一条包含猝灭剂(称为猝灭探针)而另一条包含荧光团(称为荧光探针)，在LAMP反应期间，当所述两条链互相替换时，产生荧光信号；中国专利申请202110824236.7公开了一种基于LAMP技术检测新型冠状病毒的引物探针组合、试剂盒及检测方法，所述引物探针组合包括N基因引物探针组合和/或E基因引物探针组合，所述探针包含两条寡核苷酸链，其中第一寡核苷酸链包含位于3
’
端的淬灭剂，第二寡核苷酸链包含位于5
’
端的荧光基团并在其5
’
部分与第一寡核苷酸链互补，在
环介导等温扩增反应期间，当所述两条寡核苷酸链互相替换时，产生荧光信号。
[0006]因此需要建立一种简单、快速、灵敏、特异的技术方案实现对肉类及肉制品来源的快速检测。

技术实现思路

[0007]为克服现有技术的缺陷，本专利技术特此提出了用于肉类掺假鉴别的组合物及含其试剂盒。
[0008]本专利技术引入环介导等温扩增(LAMP)技术执行靶标基因的扩增，实现更为便捷高效的核酸扩增。但是传统的LAMP检测方法不能同时检测多种靶标，为了进一步简化操作步骤，实现在单个样本中同时检测多个靶标，设计一种基于DNA糖基酶激活探针荧光的单体系多重LAMP策略，实现对牛肉和猪肉的同时快速检测。该探针中引入含修饰碱基的核苷酸，能被DNA糖基酶进行特异性识别并激活荧光，相比于现有的仅基于链置换反应的荧光探针，进一步提高了反应的特异性。在此基础上，由于荧光产生不受引物二聚体形成的影响，可通过增加引物浓度来提高灵敏度。
[0009]此外，本专利技术选用的种属特异性基因cytb位于呈环状、具有高拷贝数的线粒体DNA上，比核DNA更抗降解，可用于检测的目的DNA丰度会更高，从而更适用于降解和痕量检材。
[0010]本专利技术提供的技术方案如下所示：
[0011]在第一方面，本专利技术提供一种用于肉类掺假鉴别的组合物，所述组合物包括第一核酸组合物，第二核酸组合物和荧光探针组；
[0012]其中，第一核酸组合物包括：
[0013]cytb
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F3
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1，cytb
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B3
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1，cytb
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FIP
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1，cytb
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BIP
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1，cytb
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LF
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1，cytb
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LB
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1；
[0014]第二核酸组合物包括：
[0015]cytb
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F3
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2，cytb
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B3
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2，cytb
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FIP
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2，cytb
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BIP
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2，cytb
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LF
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2，cytb
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LB
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2；
[0016]所述cytb
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FIP
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1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
[0017]所述cytb
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BIP
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1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
[0018]所述cytb
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F3
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1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
[0019]所述cytb
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B3
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1的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
[0020]所述cytb
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LF
‑
1的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
[0021]所述cytb
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LB
‑
1的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
[0022]所述cytb
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FIP
‑
2的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；
[0023]所述cytb
‑
BIP
‑
2的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；
[0024]所述cytb
‑
F3
‑<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于肉类掺假鉴别的组合物，其特征在于，所述组合物包括第一核酸组合物，第二核酸组合物和荧光探针组；其中，第一核酸组合物包括：cytb
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F3
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1，cytb
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B3
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1，cytb
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FIP
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1，cytb
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BIP
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1，cytb
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LF
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1，cytb
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LB
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1；第二核酸组合物包括：cytb
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F3
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2，cytb
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B3
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2，cytb
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FIP
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2，cytb
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BIP
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2，cytb
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LF
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2，cytb
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LB
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2；所述cytb
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FIP
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1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述cytb
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BIP
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1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述cytb
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F3
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1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述cytb
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B3
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1的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述cytb
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LF
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1的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述cytb
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LB
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1的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；所述cytb
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FIP
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2的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；所述cytb
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BIP
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2的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；所述cytb
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F3
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2的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；所述cytb
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B3
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2的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；所述cytb
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LF
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2的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；所述cytb
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LB
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2的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示。2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第一核酸组合物和第二核酸组合物的GC含量在30％
‑
70％之间；和/或所述cytb
‑
FIP
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1、cytb
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BIP
‑
1、cytb
‑
FIP
‑
2和cytb
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BIP
‑
2的T
m
值在55℃
‑
70℃之间；和/或所述cytb
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F3
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1、cytb
‑
B3
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘枭男，周浒云，胡文静，严江伟，赵梦阳，王敏，
申请(专利权)人：山西医科大学，
类型：发明
国别省市：