用于鉴定LILRB阻断抗体的方法技术

本文提供了用于鉴定LILRB3活化的调节剂的方法和组合物。本文还提供了治疗癌症的方法，所述方法包括施用LILRB3活化的抑制剂。还提供了治疗自身免疫性疾病或抑制移植物排斥发作或治疗炎性病症的方法，所述方法包括向受试者施用LILRB3活化的激动剂。试者施用LILRB3活化的激动剂。试者施用LILRB3活化的激动剂。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于鉴定LILRB阻断抗体的方法
[0001]优先权要求
[0002]本申请要求美国临时申请序列号63/121,057(于2020年12月3日提交)、63/238,717(于2021年8月30日提交)和63/240,684(于3021年9月3日提交)的优先权的权益，每个申请的整个内容特此通过引用并入。
专利

[0003]本公开总体上涉及分子生物学领域。更具体地，其涉及用于鉴定LILRB3抗体的方法和组合物以及此类抗体在癌症疗法和诊断中的用途。

技术介绍

[0004]免疫检查点阻断疗法有效治疗一些类型的癌症。然而，对于大多数癌症患者来说，免疫逃避和抗性导致使之无法对这些疗法作出应答或在治疗后复发(Robert等人,2015a；2015b；Postow等人,2015)。对于白血病患者，低突变负荷和低水平的IFN
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γ导致对免疫检查点阻断的应答较弱(Curran等人,2017)。具体地，CTLA4和PD
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1/PD
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L1靶向单一疗法对于治疗患有急性髓系白血病(AML)的患者是无效的(Curran等人,2017)。几种新的免疫治疗剂最近已经得到批准。这些免疫治疗剂包括脂质体封装的化学药物、抗CD33药物缀合物以及BCL
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2、IDH1、IDH2、Flt3和hedgehog的抑制剂。这些治疗剂中的一些治疗剂有明显的毒性。此外，这些治疗剂仅在AML患者的一些亚群中是有效的，并且经常导致复发(Click等人,2018)。重要的是，鉴定AML发展和免疫抑制的分子机制，以指导更有效的治疗的开发。
[0005]具有基于胞内免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)的LILRB可以募集酪氨酸磷酸酶SHP1、SHP2和/或肌醇磷酸酶SHIP(Trowsdale等人,2015；Daeron等人,2008；Takai等人,2011；Katz,2016；Kang等人,2016；Hirayasu和Arase,2015；Deng等人,2021；van der Touw等人,2017)。由于磷酸酶在免疫活化中的负面作用，LILRB被视为是免疫检查点因子(Carosella等人,2015)。许多小组对目前对于LILRB的功能的理解做出了贡献(Trowsdale等人,2015；Daeron等人,2008；Takai等人,2011；Katz,2016；Kang等人,2016；Hirayasu和Arase,2015；Deng等人,2021；van der Touw等人,2017)。专利技术人研究了由LILRB介导的信号传导如何影响癌症发展。其显示出，LILRB2为激素Angptl2的受体，并且几种LILRB和相关的ITIM受体LAIR1支持AML发展(John等人,2018；Zheng等人,2012；Kang等人,2015；Deng等人,2018；Gui等人,2019；Anami等人,2020；Li等人,2019；Churchill等人,2020；Bergstrom等人,2021)。最近，专利技术人和其它人已经证明，阻断人髓系细胞或自然杀伤细胞中由LILRB1、LILRB2或LILRB4介导的信号传导促进其促炎活性并且增强抗肿瘤应答(Deng等人,2018；Gui等人,2019；Li等人,2019；Barkal等人,2018；Chen等人,2018)。
[0006]LILRB3为LILRB家族的成员，其在髓系细胞上限制性地表达，所述髓系细胞包括单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞(以及体外分化的肥大细胞和破骨细胞)(Deng等人,2021；Tedia等人,2003)。LILRB3含有四个胞质ITIM基序，所述胞质ITIM基序可以促进免疫应答的负调节(Coxon等人,2017)。在人髓系细胞中LILRB3的配体连接会导致
对免疫活化的抑制(Sloane等人,2004；Yeboah等人,2020)。LILRB3可以是过敏性炎症和自身免疫的抑制剂(Renauer等人,2015)。然而，尚未鉴定出LILRB3的配体(Jones等人,2016)，并且LILRB3的下游信号传导不清楚。值得注意的是，包括LILRB3在内的lLILRB是灵长类动物特有的。小鼠中LILRB3的对应蛋白PirB的其表达模式和配体不同于LILRB3的表达模式和配体(Kang等人,2016)。PirB比LILRB3更广泛地进行表达(Kang等人,2016)。LILRB3还在一些髓系白血病、B淋巴性白血病和骨髓瘤细胞中表达(Deng等人,2021；Pfistershammer等人,2009)。据报告，其与干细胞标志物CD34和骨髓瘤标志物CD138共表达(Pfistershammer等人,2009)。

技术实现思路

[0007]本公开的实施方式提供了一种鉴定LILRB3活化的调节剂的方法，所述方法包括(a)使报告细胞与半乳凝素
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4和候选物质接触，其中所述报告细胞表达具有LILRB3的外部结构域的嵌合受体；以及(b)检测所述报告细胞中的受体活化的水平，其中所述受体活化的水平相比于对照水平的变化表明，所述候选物质为LILRB3活化的调节剂。所述细胞可以为小鼠T细胞杂交瘤细胞。所述受体可以包含配对免疫球蛋白样受体β(PILRβ)的胞内结构域。所述受体可以在所述细胞中通过病毒表达载体，如逆转录病毒表达载体进行表达。
[0008]所述报告细胞可以表达报告基因，所述报告基因编码可检测的标记，并且与通过所述受体的活化调节的启动子可操作地连接。所述启动子可以为经活化的T细胞核因子(NFAT)启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子或组成型启动子。所述可检测标记可以为比色标记、荧光标记、生物发光标记或化学发光标记，并且具体地可以为GFP、YFP、RFP或D
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荧光素。检测可以包括流式细胞术分析或对发光的定量。
[0009]所述候选物质可以为抗体，如单克隆抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、人源化抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或scFv。所述对照水平可以在所述报告细胞与半乳凝素
‑
4接触时在所述报告细胞中获得。所述受体活化的水平相比于所述对照水平的提高表明，所述调节剂为激动剂。所述受体活化的水平相比于所述对照水平的降低表明，所述调节剂为拮抗剂。所述候选物质可以与底物连接，或者所述候选物质可以与表达FcR的细胞连接。
[0010]还提供了一种组合物，其包含候选LILRB3调节剂；半乳凝素
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4；以及报告细胞，所述报告细胞表达具有LILRB3的胞外结构域的嵌合受体，其中所述报告细胞具有指示受体活化的表型。
[0011]在另一实施方式中，提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包含：重链(HC)可变区(VH)和轻链(LC)可变区(VL)，所述VH和所述VL包含如表3和4中所示的克隆配对的CDR序列；以及其变体，其中所述HC
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CDR和/或所述LC
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种鉴定LILRB3活化的调节剂的方法，所述方法包括：(a)使报告细胞与半乳凝素
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4和候选物质接触，其中所述报告细胞表达具有LILRB3的外部结构域的嵌合受体；以及(b)检测所述报告细胞中的受体活化的水平，其中所述受体活化的水平相比于对照水平的变化表明，所述候选物质为LILRB3活化的调节剂。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞为小鼠T细胞杂交瘤细胞。3.根据权利要求1至2所述的方法，其中所述受体包含配对免疫球蛋白样受体β(PILRβ)的胞内结构域。4.根据权利要求1至3所述的方法，其中所述受体是在所述细胞中通过病毒表达载体表达的。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述病毒表达载体为逆转录病毒表达载体。6.根据权利要求1至5所述的方法，其中所述报告细胞表达报告基因，所述报告基因编码可检测的标记并且与通过所述受体的活化所调节的启动子可操作地连接。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述启动子为经活化的T细胞核因子(NFAT)启动子。8.根据权利要求6所述的方法，其中所述启动子为诱导型启动子、组织特异性启动子或组成型启动子。9.根据权利要求6所述的方法，其中所述可检测标记为比色标记、荧光标记、生物发光标记或化学发光标记。10.根据权利要求6所述的方法，其中所述可检测标记为GFP、YFP、RFP或D
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荧光素。11.根据权利要求6所述的方法，其中检测步骤包括流式细胞术分析或对发光的定量。12.根据权利要求1至11所述的方法，其中所述候选物质为抗体。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述抗体为单克隆抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、人源化抗体、Fab、Fab
′
、F(ab
′
)2、Fv或scFv。14.根据权利要求12所述的方法，其中所述抗体为单克隆抗体。15.根据权利要求1至14所述的方法，其中所述对照水平是在所述报告细胞与半乳凝素
‑
4接触时在所述报告细胞中获得的。16.根据权利要求1至15所述的方法，其中所述受体活化的水平相比于所述对照水平的提高表明，所述调节剂为激动剂。17.根据权利要求1至15所述的方法，其中所述受体活化的水平相比于所述对照水平的降低表明，所述调节剂为拮抗剂。18.根据权利要求1至17所述的方法，其中所述候选物质与底物连接。19.根据权利要求1至18所述的方法，其中所述候选物质与表达FcR的细胞连接。20.一种组合物，其包含：候选LILRB3调节剂；半乳凝素
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4；以及报告细胞，所述报告细胞表达具有LILRB3的胞外结构域的嵌合受体，其中所述报告细胞具有指示受体活化的表型。21.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合
片段包含：重链(HC)可变区(VH)和轻链(LC)可变区(VL)，所述VH和所述VL包含如表3和4中所示的克隆配对的CDR序列；以及其变体，其中所述HC
‑
CDR和/或所述LC
‑
CDR中的一者或多者具有一个、两个或三个氨基酸取代、添加、缺失或其组合。22.根据权利要求21所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的单克隆抗体为鼠类抗体、啮齿动物抗体、兔抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。23.根据权利要求21所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段为重组ScFv(单链片段可变)抗体、Fab片段、F(ab
′
)2片段或Fv片段。24.根据权利要求21所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的单克隆抗体为人抗体。25.根据权利要求21所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中VH链和VL链具有分别与附录II和IV的克隆配对的序列至少90％或95％相同的氨基酸序列。26.根据权利要求21所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中VH链和VL链由分别与附录I和III的克隆配对的序列至少80％或90％相同的核酸序列编码。27.根据权利要求21所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中VH链和VL链具有分别与附录II和IV的克隆配对的序列相同的氨基酸序列。28.根据权利要求21所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中VH链和VL链由分别与附录I和III的克隆配对的序列相同的核酸序列编码。29.根据权利要求21至28所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的单克隆抗体为人源化抗体。30.根据权利要求21至28所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为嵌合抗体。31.根据权利要求21至30所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其诱导LILRB3的活化。32.根据权利要求21至30所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其抑制LILRB3的活化。33.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其与根据权利要求21至32中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段竞争同一表位。34.一种药物组合物，其包含根据权利要求21至33中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。35.一种分离的核酸，其编码根据权利要求21至33中任一项所述的分离的单克隆抗体。36.一种载体，其包含根据权利要求35所述的分离的核酸。37.一种宿主细胞，其包含根据权利要求36所述的载体。38.根据权利要求37所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为哺乳动物细胞。39.根据权利要求37所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为CHO细胞。40.一种杂交瘤或经工程化的细胞，其编码和/或产生根据权利要求21至33中任一项所述的分离的单克隆抗体。41.一种产生抗体的方法，所述方法包括在适于表达所述抗体的条件下培养根据权利要求37所述的宿主细胞，以及回收所述抗体。42.一种嵌合抗原受体(CAR)蛋白，其包含根据权利要求21至33中任一项所述的抗原结
合片段。43.一种分离的核酸，其编码根据权利要求42所述的CAR蛋白。44.一种载体，其包含根据权利要求43所述的分离的核酸。45.一种经工程化的细胞，其包含根据权利要求43所述的分离的核酸。46.根据权利要求45所述的经工程化的细胞，其中所述细胞为T细胞、NK细胞或巨噬细胞。47.一种治疗受试者的癌症或改善受试者的癌症的效应的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求21至33中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求45或46所述的经工程化的细胞。48.根据权利要求47所述的方法，其中所述方法减少或根除所述受试者的肿瘤负荷。49.根据权利要求47所述的方法，其中所述方法减少肿瘤细胞的数量。50.根据权利要求47所述的方法，其中所述方法减小肿瘤大小。51.根据权利要求47所述的方法，其中所述方法减少或预防肿瘤转移。52.根据权利要求47所述的方法，其中所述方法根除所述受试者的肿瘤。53.根据权利要求47所述的方法，其中所述癌症为实体癌。54.根据权利要求53所述的方法，其中所述实体癌选自由以下组成的组：肾上腺癌、胆管癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠癌、结直肠癌、食道癌、眼癌、胃癌、胶质母细胞瘤、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、间皮瘤、黑色素瘤、默克尔细胞癌(merkel cell cancer)、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、松果体瘤、前列腺癌、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、肉瘤、皮肤癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宫癌和阴道癌。55.根据权利要求47所述的方法，其中靶向单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、嗜中性粒细胞和其它髓系细胞、髓系源性抑制细胞、肿瘤相关巨噬细胞和其它免疫抑制髓系细胞。56.根据权利要求47所述的方法，其中所述癌症为血液系统恶性病。57.根据权利要求56所述的方法，其中所述血液系统恶性病选自由以下组成的组：急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓系白血病(AML)、B细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、母细胞性浆细胞样树突状细胞赘生物(BPDCN)、慢性髓单核细胞白血病(CMML)、慢性髓细胞白血病(CML)、前B急性淋巴细胞性白血病(前B ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、结外NK/T细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、重链疾病、HHV8相关原发性渗出性淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、原发性CNS淋巴瘤、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、富含T细胞/组织细胞的B细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin
′
s lymphoma)、非霍奇金氏淋巴瘤(non
‑
Hodgkin
′
s lymphoma)、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom
′
s macroglobuline...

【专利技术属性】
技术研发人员：张成城，吴国进，金载协，陈贺愈，邓觅，安志强，张凝艳，R，
申请(专利权)人：德克萨斯大学体系董事会，
类型：发明
国别省市：