一株针对花鲈的鳗弧菌减毒菌株的构建方法技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，提供一种鳗弧菌减毒菌株的构建方法，该方法构建得到的鳗弧菌毒性较弱，为研究鳗弧菌作为减毒活疫苗或免疫添加剂的开发提供实验基础；包括如下步骤：S1.克隆鳗弧菌溶血素基因vah1、vah4和重复序列毒素rtxA，然后通过酶切连接方式分别构建重组质粒pSR47S－vah1、pSR47S－vah4和pSR47S－rtxA，分别转化到大肠杆菌CC118中并筛选重组成功的菌株；S2.借助辅助质粒对供体菌和受体菌鳗弧菌野生株进行接合实验，利用抗生素与蔗糖筛选压力获得减毒菌株

【技术实现步骤摘要】
一株针对花鲈的鳗弧菌减毒菌株的构建方法


[0001]本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一株针对花鲈的鳗弧菌减毒菌株的构建方法。

技术介绍

[0002]细菌性疾病一直是海水养殖产业的困扰问题，其中弧菌作为细菌性疾病最主要的病原菌之一，一直以来都是水产研究的重要关注点。鳗弧菌是弧菌病的重要来源，能引起水产动物致病性的出血性败血病。据已有的研究报道鳗弧菌影响各种生活在海洋和淡水、半咸水鱼的双壳类和甲壳类动物，在水产养殖中造成了严重经济损失。
[0003]在国家禁抗的浪潮下，目前市面上鱼用疫苗以灭活疫苗为主。鳗弧菌作为一种革兰氏阴性菌，其胞外分泌的溶血素会引发较大的应激反应，保护效果不佳。溶血素作为鳗弧菌致病的重要毒力因子，可通过溶解宿主红细胞从而释放血红蛋白，这一过程既为细菌繁殖提供营养，又导致了宿主的出血性败血症，且可以作用于宿主的神经，造成一定的神经损伤。2005年Rodkhum等人(Rodkhum C，Hirono I，CrosaJ H，et al.Four novel hemolysin genes of Vibrio angu本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株针对花鲈的鳗弧菌减毒菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.克隆鳗弧菌溶血素基因vah1、vah4和重复序列毒素rtxA，然后通过酶切连接方式分别构建重组质粒pSR47S－vah1、pSR47S－vah4和pSR47S－rtxA，分别转化到大肠杆菌CC118中并筛选重组成功的菌株；S2.借助辅助质粒对供体菌CC118pSR47S－vah1和受体菌鳗弧菌野生株进行接合实验，利用抗生素与蔗糖筛选压力获得鳗弧菌减毒菌株
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vah1，依次将供体菌更换为CC118pSR47S－vah4和CC118pSR47S－rtxA，筛选得到鳗弧菌减毒菌株
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vah1－vah4－rtxA；S3.对花鲈幼鱼分别注射鳗弧菌野生株和减毒菌株
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vah1－vah4－rtxA，发现与野生株对比，花鲈感染鳗弧菌减毒菌株后的LD50显著降低，表明本发明成功构建了一株毒力明显降低的鳗弧菌基因工程减毒菌株。2.根据权利要求1所述的一株针对花鲈的鳗弧菌减毒菌株的构建方法，其特征在于：所述鳗弧菌属于弧菌属的鳗弧菌775菌种。3.根据权利要求1所述的一株针对花鲈的鳗弧菌减毒菌株的构建方法，其特征在于：所述基因工程技术手段为同源重组技术。4.根据权利要求1所述的一株针对花鲈的鳗弧菌减毒菌株的构建方法，其特征在于：步骤S1中克隆所用的扩增引物序列如表1所示。5.根据权利要求1所述的一株针对花鲈的鳗弧菌减毒菌株的构建方法，其特征在于，重组质粒pSR47S－vah1、pSR47S－vah4和pSR47S－rtxA的构建方法为：(1)分别设计鳗弧菌溶血素基因vah1、vah4和重复序列毒素rtxA上游同源臂up－F、up－R和下游同源臂引物down－F、down－R，并对up－F、down－R添加合适酶切位点，对up...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜维，胡存洁，方秀，陈小辉，鲍宝龙，
申请(专利权)人：福建闽威实业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：