一种获得遗传稳定的具有目标性状的微藻的方法及超突变株技术

本发明专利技术涉及一种获得遗传稳定的具有目标性状的微藻的方法，包括以下步骤：获得复制保真机制缺陷株；对复制保真机制缺陷株使用高温高光胁迫条件进行培养传代，获得中性超突变株文库；施加选择压力，筛选得到具有目的性状的超突变进化株；恢复具有目的性状超突变进化株的保真机制，得到遗传稳定的具有目的性状的微藻。本发明专利技术还提供了聚球藻PCC 7942的突变率提高的复制保真机制缺陷株。该方法克服了传统进化工程策略中采用常规理化诱变因子的缺陷，在短期内获得遗传多样性更为丰富的超突变株文库，但是不影响文库中的突变株本身的活力。此外，该方面获得的超突变体文库是进展性的，随着传代培养的继续，可获得更为丰富的超突变体文库。文库。文库。

【技术实现步骤摘要】
一种获得遗传稳定的具有目标性状的微藻的方法及超突变株


[0001]本专利技术属于代谢工程领域，更特别地，涉及一种获得遗传稳定的具有目标性状的微藻的方法，以及聚球藻PCC 7942的突变率提高的复制保真机制缺陷株。

技术介绍

[0002]蓝细菌是一类进行植物型放氧光合作用的原核微生物，能够利用太阳能将二氧化碳转化为各类碳水化合物。因为具有结构简单、生长迅速、遗传改造便捷等优势，蓝细菌被认为是极具潜力的生物能源和生物基化学品光合合成平台。通过外源代谢途径的引入和背景代谢网络的改造，已经在蓝细菌中实现了烃、糖、醇、酮、酸、萜类以及脂肪族化合物等数十种天然和非天然代谢产物的定向光合合成。
[0003]基于经济和环境上的整体考虑，蓝细菌光合细胞工厂的规模化培养需要在户外开放式环境中进行。蓝细菌工程藻株要面临远比实验室条件下严苛的高温、高光胁迫以及昼夜循环条件下光照
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温度
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碳源的动态变化；此外，为了控制潜在的杂菌污染，工程藻株培养往往还需要在高盐、高酸/碱条件下进行。
[0004]现在常用于构建光合细胞工厂的蓝细菌底盘细胞的天然生理耐受性通常难以满足要求，在更为严苛的规模化培养体系中，工程藻株的生物量积累和产物合成都受到较大影响，进而影响了光合生物制造技术的规模化应用和推广前景。
[0005]进化工程策略是一种改造微生物生理耐受性表型的方法，通过模拟自然界进化中变异
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选择过程在基因组水平上来改良优化微生物的性状。目前而言，制约进化工程策略最大的因素有两个，1)如何获得积累了大量突变的文库；2)如何从文库中筛选到具有稳定遗传目标性状的突变株。
[0006]传统的实验室适应性进化方法由于细胞自发的突变率极低，需要长时间连续传代以积累遗传多样性，因此时间周期长(通常是几个月甚至几年)。结合物理或者化学方法进行诱变可以提高突变率，然而使用的诱变剂会对细胞造成极大的损伤，并且使用的化学诱变因子通常对人体和环境也有毒害作用。另外，物理或者化学诱变需要在长期连续传代过程中反复施加人工操作。因此，需要一种新的方法来构建突变体文库。

技术实现思路

[0007]为解决以上问题，本专利技术提供了一种获得遗传稳定的具有目标性状的微藻的方法，包括以下步骤：
[0008]S1：使用遗传操作手段，破坏出发微藻的DNA复制保真机制，获得突变率提高的复制保真机制缺陷株；
[0009]S2：对所述突变率提高的复制保真机制缺陷株使用高温高光胁迫条件进行培养传代，获得中性超突变株文库；
[0010]S3：对所述中性超突变株文库施加选择压力，筛选得到具有目的性状的超突变进化株；
[0011]S4：恢复所述具有目的性状的保真机制，得到所述遗传稳定的具有目的性状的微藻。
[0012]上述方法克服了传统进化工程策略中采用常规理化诱变因子的缺陷，可在短期内获得遗传多样性更为丰富的超突变株文库，但是对文库中的突变株本身的活力不产生过于剧烈的影响。此外，该方面获得的超突变体文库是进展性的，随着传代培养的继续，可获得更为丰富的超突变体文库。因此，本专利技术的方法能够缩短获得目的性状的周期，同时无需人工反复诱变操作从而可以节省人力物力，并且也更加环保(无需化学诱变剂)。
[0013]在一个具体实施方案中，通过使参与DNA复制保真过程中的基因失活，或者过表达使DNA复制过程中容易出错的基因，来破坏所述出发微藻的保真机制。
[0014]在一个具体实施方案中，所述参与DNA复制保真过程中的基因选自mutS、mutL、dam、xth、uvrB、uvrC、mutY和mutM中一个或多个的组合；
[0015]所述使DNA复制过程容易出错的基因选自umuC、umuD、recN和recA中一个或多个的组合。
[0016]在一个具体实施方案中，所述出发微藻为聚球藻PCC7942(Synechococcus elongatus PCC 7942)或集胞藻PCC 6803(Synechocystissp.PCC 6803)。
[0017]在一个具体实施方案中，所述超突变株中mutS基因被失活，并且包含recA基因过表达框。该突变株的突变率相对野生型显著提高，本底突变率是野生型PCC7942的近200倍，可用于构建遗传多样性丰富的大型超突变体文库。
[0018]在一个具体实施方案中，S2中使用非致死性的高温和/或高光胁迫进行诱变，获得遗传多样性更丰富的超突变株文库。例如，在30
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35℃下组合500
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1500μmol photons/m2/s的光照；也可在35
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45℃下，组合100
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500μmol photons/m2/s的光照；也可组合使用高温(35
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45℃)和高光条件(500
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1500μmol photons/m2/s)，这些条件均可诱导超突变株的突变率显著提高。
[0019]在一个具体实施方案中，诱变条件为，温度为35
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45℃，光强为500
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1500μmol photons/m2/s。组合使用高温和高光条件进行诱变可大幅提高该超突变株的突变率，达到野生型突变率的数十倍到数千倍。通过结合适当的温度和光强等诱导条件，该超突变株的突变率可提高至野生型的8000倍以上。
[0020]在一个具体实施方案中，S3中采用的选择压力为足以使所述出发微藻致死的胁迫条件。例如，使出发微藻致死的温度、光照强度、pH、离子强度等。
[0021]本专利技术还提供了一种聚球藻PCC 7942的突变率提高的复制保真机制缺陷株，所述突变率提高的复制保真机制缺陷株中，mutS基因被失活，并且包含recA基因过表达框。该突变株的突变率相对野生型显著提高，本底突变率是野生型PCC 7942的近200倍，通过结合适当的温度和光强等诱导条件，该超突变株的突变率可提高至野生型的8000倍以上，可用于构建遗传多样性丰富的大型超突变体文库。
附图说明
[0022]图1为保真机制相关基因被敲除或过表达的聚球藻PCC 7942的突变率统计图，其中，A为单突变株，B为多重突变株。
[0023]图2为野生型PCC 7942(A)和超突变株HS84(B)在不同的温度和光强下的突变率统
计图。
[0024]图3为野生型和超突变株HS84制备的超突变株文库涂布的平板在高温高光(野生型致死的高温高光条件)下培养后的照片(A)以及超突变株长出的藻株在平板上划线后在高温高光下培养后的照片(B)。
[0025]图4为应用超突变株HS84获得目的性状的流程(a)，以及获得的三个耐高温高光藻株在不同条件下培养的生长曲线。
[0026]图5为三个耐高温高光藻株的突变率统计图。
[0027]图6为野生型和超突变株HS84制备的超突变株文库涂布的平板在高pH下培养后的照片(A)以及超突变株长出的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速获得遗传稳定的具有目标性状的微藻的方法，包括以下步骤：S1：使用遗传操作手段，破坏出发微藻的保真机制，获得突变率提高的复制保真机制缺陷株；S2：对所述突变率提高的复制保真机制缺陷株使用高温高光胁迫条件进行培养传代，获得中性超突变株文库；S3：对所述中性超突变株文库施加选择压力，筛选得到具有目的性状的超突变进化株；S4：恢复所述具有目的性状的进化株的保真机制，得到所述遗传稳定的具有目的性状的微藻。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过使参与DNA复制保真过程中的基因失活，或者过表达使DNA复制过程中容易出错的基因，来破坏所述出发微藻的保真机制。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述参与DNA复制保真过程中的基因选自mutS、mutL、dam、xth、uvrB、uvrC、mutY和mutM中一个或多个的组合；所述使DNA复制过程容易出错的基因选自umuC、umuD、recN和recA中一个或多个的组合。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述出发微藻为蓝藻。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕雪峰，孙绘梨，栾国栋，马依凡，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：