本发明专利技术提供了一种Foxg1p.Tyr392X点突变小鼠模型的构建方法及其应用，属于动物模型领域。该方法包括以下步骤：构建打靶载体；对sgRNA序列进行设计并制备成显微注射RNA；将Cas9、显微注射RNA、打靶载体注射到小鼠的受精卵，经发育形成F0代小鼠；将F0代小鼠与野生型小鼠交配获得F1代小鼠并对其进行基因型鉴定及Southernblot鉴定等，确认Foxg1基因点突变小鼠模型构建成功。本发明专利技术是基于临床患者突变位置和类型所构建的Foxg1点突变小鼠模型，能够比较贴切地重现真实疾病的发生和发展过程，对于个性化探讨FOXG1综合征的致病机理、治疗方法、药物筛选等方面具有重要意义。药物筛选等方面具有重要意义。药物筛选等方面具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
一种Foxg1 p.Tyr392X点突变小鼠模型的构建方法及其应用
[0001]本专利技术涉及一种Foxg1 p.Tyr392X点突变小鼠模型的构建方法及其应用，属于动物模型领域。
技术介绍
[0002]叉头框转录因子FOXG1杂合突变导致FOXG1综合征，患者表现为发育迟缓、认知缺陷、社交障碍、运动障碍等自闭症核心症状。此类神经发育疾病严重影响患者身心健康，给患者家庭和社会带来了沉重的精神和经济负担。
[0003]人FOXG1基因位于14号染色体q12上，目前已鉴定出多种FOXG1突变，已有的数据表明FOXG1突变位点不同，患者临床症状也各不相同。具体而言，人FOXG1蛋白全长489个氨基酸，包含N端叉头结构域(FBD，181
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275位氨基酸)，Groucho结合结构域(GBD，307
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317位氨基酸)，JARID1B结合结构域(JBD，383
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406位氨基酸)和C端结构域。其中JBD结构域可招募其他转录抑制因子(如JARID1B，一种去甲基化酶)与FOXG1共同调控下游靶基因。临床上，JBD到C端结构域的突变主要为无义突变(其比例约为3/4)。
[0004]FOXG1 p.Tyr400X无义突变的患者，表现出典型的自闭症样行为，具有社交障碍、语言障碍、运动障碍、眼神接触障碍和手部重复刻板行为等。由于物种差异，在小鼠中该突变位置对应的是Foxg1 p.Tyr392X。以往针对该位点突变的相关研究报道甚少，目前仅有一例并且是在细胞系中进行的实验。但从未有研究报道过Foxg1 p.Tyr392X在生物体内的功能，并且目前基因过表达和敲除小鼠均无法贴切地模拟临床患者的症状，无法体现出FOXG1蛋白在第392位酪氨酸处发生无义突变所导致的生物学功能。因此，Foxg1 p.Tyr392X无义突变小鼠模型的构建十分有必要。
技术实现思路
[0005]针对现有技术的不足，为了更加真实贴切的模拟FOXG1综合征患者的表型，本专利技术的目的在于提供一种Foxg1 p.Tyr392X点突变小鼠模型的构建方法及其应用。具体地，本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：
[0006]根据小鼠Foxg1未突变前基因序列，设计sgRNA序列；
[0007]按照所述设计的sgRNA序列合成oligos，所述oligos通过Gibson Assembly方法连入包含Cas9的pCS
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4G载体；
[0008]设计引物构建打靶载体；
[0009]将Cas9、sgRNA和打靶载体显微注射到小鼠受精卵中，得到F0代小鼠，设计引物对F0代小鼠进行测序；
[0010]所述F0代小鼠与野生型小鼠交配，得到F1代小鼠，设计引物对F1代小鼠进行测序。
[0011]进一步，所述小鼠Foxg1未突变前基因序列包括SEQ ID NO.25所示序列。
[0012]进一步，所述sgRNA包括5
’
靶位点的SEQ ID NO.1～8所示序列和3
’
靶位点的SEQ ID NO.9～16所示序列。
[0013]优选地，所述5
’
靶位点的sgRNA包括SEQ ID NO.7所示序列，所述3
’
靶位点的sgRNA序列包括SEQ ID NO.16所示序列。
[0014]进一步，所述pCS
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4G序列包括SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28所示序列。
[0015]进一步，所述打靶载体的基因序列包括SEQ ID NO.26所示序列。
[0016]进一步，对F0代小鼠基因型进行鉴定和测序的引物序列包括SEQ ID NO.17～20所示序列。
[0017]进一步，对F1代小鼠基因型进行鉴定和测序的引物序列包括SEQ ID NO.21～24所示序列。
[0018]本专利技术的有益效果：
[0019]本专利技术提供了一种能够模拟FOXG1综合征中Foxg1 p.Tyr400X患者的无义突变及其表型的Foxg1 p.Tyr392X小鼠，为神经发育障碍的发病机制研究提供了合适的工具，并为临床开发和干预FOXG1综合征的药物提供了新的思路。对于个性化探讨FOXG1综合征的致病机理、治疗方法、药物筛选等方面有重要意义。此外，Foxg1 p.Tyr392X点突变小鼠模型有利于对Foxg1第392位氨基酸位点、JBD(Foxg1的JARID1B结合结构域)及C端结构域的功能进行更深入的探索，填补该研究方向的空白。
附图说明
[0020]图1为本专利技术的Foxg1 p.Tyr392X点突变小鼠模型的设计方案示意图。
[0021]图2为本专利技术所采用的Southern blot筛选策略示意图。
[0022]图3为本专利技术已插入SEQ ID NO.7所示序列的pCS
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4G载体图谱。
[0023]图4为本专利技术已插入SEQ ID NO.16所示序列的pCS
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4G载体图谱。
[0024]图5为本专利技术构建的sgRNA的活性检测结果。
[0025]图6为本专利技术构建的打靶载体图谱。
[0026]图7为本专利技术的F0代小鼠PCR鉴定图。
[0027]图8为本专利技术的F1代小鼠PCR鉴定图。
[0028]图9为本专利技术的F1代PCR阳性小鼠的Southern blot检测结果图。
[0029]图10为本专利技术的F1代小鼠基因测序图(c.1176C>A,p.Tyr392*)。
具体实施方式
[0030]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清晰、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创新性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0031]本专利技术中涉及的专业术语解释如下表1所示：
[0032]表1
[0033][0034]实施例1：
[0035]本实施例公开了一种Foxg1 p.Tyr392X点突变小鼠模型的构建方法及其应用，包括以下步骤：
[0036](1)打靶载体的构建：
[0037]利用CRISPR/Cas9技术，构建针对目的基因的sgRNA，体外转录为mRNA，指导Cas9蛋白在特定位点剪切DNA双链。首先分析FOXG1综合征的病例突变位点和临床症状，该临床病例在FOXG1第400位氨基酸对应的三联密码子由TAC变成TAA(FOXG1编码序列第1176位碱基C突变为碱基A)后，编码酪氨酸的三联密码子变为终止密码子，其症状表现为智力障碍、运动障碍、眼神接触障碍、手部刻板动作、脊柱侧弯、肌张力不足等。接下来根据物种、基因名称知道基因的编码区，分析与人相应的基因组结构，确定在小鼠Foxg1基因的第392位氨基酸引入终止密码子。sgRNA设计在本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种Foxg1 p.Tyr392X点突变小鼠模型，其特征在于，所述小鼠的Foxg1基因编码序列第1176位碱基C突变为碱基A。2.一种Foxg1 p.Tyr392X点突变小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：根据小鼠Foxg1未突变前基因序列，设计sgRNA序列；按照所述设计的sgRNA序列合成oligos，所述oligos通过Gibson Assembly方法连入包含Cas9的pCS
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4G载体；设计引物构建打靶载体；将Cas9、sgRNA和打靶载体显微注射到小鼠受精卵中，得到F0代小鼠，设计引物对F0代小鼠进行测序；所述F0代小鼠与野生型小鼠交配，得到F1代小鼠，设计引物对F1代小鼠进行测序。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述小鼠Foxg1未突变前基因序列包括SEQ ID NO.25所示序列。4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述sgRNA包括在5
’
靶位点和3
’
端靶位点分别设计的...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵春杰，刘肖，程珊珊，巴茹，刘俊华，周雪，杨燕，刘琍，魏义全，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：
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