一种抗细菌耐受的多价溶藻弧菌噬菌体VAP230304及其应用制造技术

本发明专利技术属于水产养殖业微生物技术应用领域，公开了一种抗细菌耐受的多价溶藻弧菌噬菌体VAP230304及其应用，所述噬菌体的保藏编号为CCTCC M 20231412。该溶藻弧菌噬菌体VAP230304应用于水产养殖多种细菌的生物控制过程中，具有裂解谱广、细菌抗性低、耐盐性强、杀菌效率高，不易让细菌产生耐药性的优势，对水产中占比大的弧菌及嗜水气单胞菌的预防和杀灭具有巨大应用潜力，同时具有优秀的杀菌效率和抑菌表现。率和抑菌表现。

【技术实现步骤摘要】
一种抗细菌耐受的多价溶藻弧菌噬菌体VAP230304及其应用


[0001]本专利技术涉及水产养殖业微生物技术应用领域，具体涉及一种抗细菌耐受的多价溶藻弧菌噬菌体VAP230304及其应用。

技术介绍

[0002]噬菌体是地球上数量最多的生物，它们与细菌有着特异性的相互作用，并在细菌裂解后释放后代。噬菌体分为烈性噬菌体和温和噬菌体，烈性噬菌体可以感染和裂解宿主细菌，具有特异性强、自我增殖快的特点。但由于噬菌体与细菌相互作用产生共同进化，针对噬菌体的感染进化出多种抗感染机制，即产生抗噬菌体致病菌，进而限制了噬菌体疗法的应用，因此寻找或改造噬菌体使其不易让细菌产生耐受十分有必要。
[0003]申请CN202310039349.5公开了一种溶藻弧菌噬菌体GRNRZ
‑
P25及其应用，该噬菌体具有裂解谱广、杀菌效率高的优势，对水产养殖中溶藻弧菌的预防和杀灭具有巨大应用潜力，同时具有优秀的杀菌效率和抑菌表现，抑菌作用时间长。
[0004]申请CN202210332738.2公开了一株高效裂解溶藻弧菌噬菌体PVA23及其用途，该噬菌体具有效价高、裂解率高、增殖力强、潜伏期短、爆发量大的特点，且安全性高、环境友好，并具有良好的温度和酸碱耐受能力，能适应更严苛的应用环境，且其感染复数极低，能够快速有效地杀灭溶藻弧菌，预防溶藻弧菌病害，尤其能够快速有效抑制人工养殖对虾养殖池中溶藻弧菌的生长，在水产养殖及其他环境中的溶藻弧菌防控方面具有重要的应用价值。
[0005]申请CN202210332740.X公开了一株具有宽裂解谱的溶藻弧菌噬菌体PVA8及其用途，该噬菌体具有效价高、裂解谱宽、增殖力强、爆发量大的特点，能裂解溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌以及河流弧菌等多种致病性弧菌，并对溶藻弧菌具有极低的感染复数，能够有效抑制弧菌的生长，能够作为生物抗菌剂应用于防控水产养殖中弧菌的污染。
[0006]尽管现有的溶藻噬菌体裂解谱较广、杀菌效率较高，但由于其细菌可能会产生抗性，导致其无法高效且持久抑菌，而本专利技术中VAP230304噬菌体的细菌抗性低、杀菌效率高，具有不易让细菌产生耐药性的优势，且对水产中占比大的弧菌及嗜水气单胞菌均有杀灭作用，因此具有巨大应用潜力。

技术实现思路

[0007]本专利技术目的是提供一种抗细菌耐受的多价溶藻弧菌噬菌体(Vibrio alginolyticu phage)VAP230304，所述噬菌体的保藏编号为：CCTCC NO:M20231412。
[0008]本专利技术的另一个目的在于提供溶藻弧菌噬菌体VAP230304在水产细菌裂解中的应用。为了实现上述目的，本专利技术是通过如下的技术方案来实现：
[0009]申请人在江苏南通某水产养殖水塘，分离出一株溶藻弧菌噬菌体VAP230304，所述噬菌体在2023年8月10日保藏至中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学；保藏编号为CCTCC NO：M20231412，分类命名：Vibrio alginolyticu phage VAP230304。
[0010]本专利技术的保护范围还包括：溶藻弧菌噬菌体VAP230304在制备水产细菌裂解剂中的应用。
[0011]以上所述的应用中，优选的，所述的水产细菌包括：水产弧菌、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和/或变形杆菌(Proteus)；
[0012]以上所述的应用中，优选的，所述的水产弧菌包括：溶藻弧菌(Vibrio algimolyticus)，副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)，哈维氏弧菌(Vibrio harveyia)和/或鳗弧菌(Vibrio anguillarum)。
[0013]与现有技术相比，本专利技术具有以下效果：
[0014]1)噬菌体VAP230304裂解谱广，具有多价性：对224株溶藻弧菌中213株具有裂解效果，裂解率达95.1％；对138株副溶血弧菌中93株具有裂解效果，裂解率达67.4％；对72株哈维氏弧菌中48株具有裂解效果，裂解率达66.7％；对82株嗜水气单胞菌中54株有效，解裂解率达65.9％；对64株变形杆菌中31株有效，解裂解率达48.4％；对86株鳗弧菌中17株有效，裂解率达19.8％，对水产中占比大的多种致病菌均有效果。
[0015]2)噬菌体VAP230304具有高发酵率，在最佳感染复数MOI＝0.001时，发酵6h，效价可达2.5
×
10
11
PFU/mL，为工业发酵提供了理论基础。
[0016]3)噬菌体VAP230304不易让细菌产生耐药性，对宿主菌进行测试，噬菌体VAP230304不敏感突变频率仅为3.2
‰
。
[0017]4)溶藻弧菌噬菌体VAP230304环境耐受性好：在pH为5
‑
9范围内处理2h其效价无明显变化，在pH为4、10范围内处理2h其效价略有变化；在温度为60℃以下较易存活，在40℃以下处理1h效价不受影响；在盐浓度是1.5％
‑
3.5％范围内，噬菌体均可保持较高的活性，且当盐浓度是2.5％时，噬菌体效价达到最大，为4.7
×
109PFU/mL，随后随着盐浓度增加噬菌体浓度稍有下降，盐浓度高于3.5％时噬菌体浓度迅速下降。
附图说明
[0018]图1为溶藻弧菌噬菌体VAP230304的噬菌斑图。
[0019]图2为噬菌体VAP230304的宿主谱及裂解率图。
[0020]图3为溶藻弧菌噬菌体VAP230304的pH值稳定性示意图。
[0021]图4为本专利技术一种溶藻弧菌噬菌体VAP230304于不同温度的稳定性示意图。
[0022]图5噬菌体渗透压稳定性测定。
具体实施方式
[0023]为使本专利技术实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本专利技术。
[0024]本专利技术所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方式；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
[0025]实施例1：
[0026]溶藻弧菌噬菌体VAP230304的分离纯化
[0027]在江苏南通某水产养殖水塘采集水样10份，每份50mL，6000rpm离心10min，取上清，并用0.22um滤器除菌，取5mL处理后上清液与0.5mL溶藻弧菌(浓度为5
×
108CFU/mL左
右)混合均匀，放置于37℃培养箱中150rpm振荡发酵培养过夜；取发酵后液体6000rpm离心10min，取上清，并用0.22um滤器除菌，得种子滤液，取滤液100uL与300uL溶藻弧菌(浓度为5
×
108CFU/mL左右)混合均匀，将混合物与2％氯化钠TSB半固体(含0.65％琼脂)混合均匀，浇筑在2％氯化钠TSA底板上，待凝固后，将培养皿放置于37℃培养箱中培养过夜。记录培本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. 一株分离的溶藻弧菌噬菌体（Vibrio alginolyticu phage）VAP230304，所述噬菌体的保藏编号为：CCTCC NO:M20231412。2.权利要求1所述的噬菌体在制备水产细菌裂解剂中的应用。3. 根据权利要求2所述的应用，所述的水产细菌为：水产弧菌、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydr...

【专利技术属性】
技术研发人员：王喜亮，黄金梅，张秀玲，田甲，周好，徐岳，张晓东，
申请(专利权)人：武汉格瑞农生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：