一种D-2-羟基戊二酸浓度的测定方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种D

【技术实现步骤摘要】
一种D
‑2‑
羟基戊二酸浓度的测定方法及试剂盒


[0001]本专利技术涉及酶法检测
，具体说是一种D
‑2‑
羟基戊二酸浓度的测定方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)或其旁系同源物IDH2(统称为IDH)的突变在各种类型的癌症中普遍存在，包括低级别胶质瘤和继发性胶质母细胞瘤、急性髓性白血病、胆管癌、软骨肉瘤、鼻窦未分化癌和血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤等。大约80％的低级别胶质瘤携带异柠檬酸脱氢酶1突变，IDH1酶活性位点的突变导致异柠檬酸酶活性明显降低，导致产生一种新型变构酶，能催化还原α
‑
酮戊二酸(α
‑
KG)到D
‑2‑
羟基戊二酸，从而使肿瘤中D
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HG蓄积。虽然IDH突变的肿瘤中D
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HG含量是正常组织中的50～100倍。
[0003]另外，D
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HG的浓度还和非肿瘤类疾病有关，如人线粒体中存在一种酶D
‑2‑r/>羟基戊二酸脱氢本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种D
‑2‑
羟基戊二酸浓度的测定方法，其特征在于：以FAD依赖型D
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羟基戊二酸脱氢酶、刃天青和PBS缓冲液体系作为工作液，实现对固体状组织切片中D
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羟基戊二酸的检测。2.根据权利要求1所述的一种D
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羟基戊二酸浓度的测定方法，其特征在于：包括以下步骤：
①
制作D
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羟基戊二酸标准品切片：将D
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羟基戊二酸加入琼脂糖水溶液中；加热搅拌至澄清透明状态，倒在凝胶板上凝固取出，切成横截面积0.1～1.5cm
×
0.1～1.5cm的长方体，将其放置在冰冻切片机的组织托盘里，在琼脂糖凝胶块上覆盖OCT包埋剂，至OCT包埋剂在冰冻切片机中冷冻为固体后，将琼脂糖凝胶切至5～25μm厚度，放至防脱载玻片，切成横截面积0.1～1cm
×
0.1～1cm的长方体，储存至
‑
20℃冰箱内，得到、不同浓度的系列D
‑2‑
羟基戊二酸标准品切片，备用；其中D
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羟基戊二酸和琼脂糖水溶液的比例为0～5.0μmol：1g；每个浓度的标准品切片设置3组平行实验；
②
待测组织样品切片处理待测组织从
‑
80℃冰箱中取出，置于冰上，放入冰冻切片机的组织托盘中，将OCT冰冻包埋剂加入到待测组织上，待OCT冰冻包埋剂变白后，将待测组织切片至5～25μm厚度，放至防脱载玻片，切成横截面积0.1～1cm
×
0.1～1cm的长方体，和标准品切片横截面积相同，得到待测组织切片，备用；每个待测组织样品切片设置3组平行实验；
③
配制染色液：染色液为pH为7.0～8.0的缓冲液，其中含有刃天青和FAD依赖型D
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羟基戊二酸脱氢酶；缓冲液为Tris
‑
Hcl缓冲液，PBS缓冲液或HEPES缓冲液，所述刃天青浓度范围为0.5uM
‑
200uM，所述FAD依赖型D
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羟基戊二酸脱氢酶浓度范围为1.3μg/ml
‑
520μg/ml；
④
组织切片的染色取15μl至100μl步骤
③
所得染色液完全覆盖于步骤
②
所得待测组织切片上，用荧光探测器检测载玻片上染色液的荧光值，持续检测1～10分钟；
⑤
标准品数据测试和结果处理将步骤
①
不同浓度的系列D
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羟基戊二酸标准品切片放在载玻片上，取15μl至100μl步骤
③
所得染色液完全覆盖，立即用荧光探测器检测,其荧光探测器特...

【专利技术属性】
技术研发人员：张文，杨木，高超，唐东起，刘江，
申请(专利权)人：山东大学第二医院，
类型：发明
国别省市：