一种原位、动态检测细胞分泌蛋白的方法技术

本发明专利技术公开一种原位、动态检测细胞分泌蛋白的方法，属于单细胞分泌物检测技术领域。所述方法为将单细胞和分泌蛋白检测试剂封装在通过涡旋震荡生成的油包水液滴中，所述的分泌蛋白检测试剂为荧光基团修饰的适配体和淬灭基团修饰的适配体互补链杂交形成的适配体信标，培养细胞一段时间，通过检测荧光强度来分析细胞实时分泌蛋白情况。该方法仅需一台小型涡旋仪，即可生成高通量的单细胞液滴，克服了现有的生产单细胞液滴的方法对复杂微流控装置的依赖。该方法操作简单，使得研究者以最少的时间、成本、精力和专业知识对单细胞分泌蛋白进行原位、动态检测。动态检测。动态检测。

【技术实现步骤摘要】
一种原位、动态检测细胞分泌蛋白的方法


[0001]本专利技术属于单细胞分泌物检测
，具体涉及一种原位、动态检测细胞分泌蛋白的方法。

技术介绍

[0002]分泌蛋白是指在细胞内合成后，分泌到细胞外起作用的蛋白质，例如：抗体、细胞因子、细胞外囊泡表面的膜蛋白等。单细胞的分泌蛋白分析对于充分理解细胞功能异质性和揭示细胞间通讯和相互作用的潜在机制至关重要。以单细胞分辨率检测分泌物的动态信息反映了生理过程中单个细胞的精确、实时的功能状态。这种测量在单细胞分析中仍然非常具有挑战性，需要高度集成的系统才能够执行单细胞分离和随后的实时分泌物检测。
[0003]干扰素γ(IFN
‑
γ)是一种主要由自然杀伤细胞和效应T细胞等免疫细胞产生的分泌蛋白，主要参与先天免疫和适应性免疫。白细胞介素6(IL
‑
6)是一种同时具备促炎性和抗炎性的细胞因子。肿瘤坏死因子(TNF
‑
α)能使多种肿瘤发生出血性坏死，主要由活化的巨噬细胞，NK细胞及T淋巴细胞产生。到目前为止，酶联免疫吸附测定(ELISA)或酶联免疫斑点(ELISPOT)是测定免疫细胞释放IFN
‑
γ的金标准技术。但是，这些方法通常用于研究群体细胞的信息，例如，单位体积培养液中的IFN
‑
γ量或IFN
‑
γ阳性细胞的百分比，因此忽略了免疫细胞的异质性。此外，这些方法难以从单个细胞收集动态数据，因此缺乏时空分辨率。细胞外囊泡(EV)是由细胞主动释放的纳米级囊泡，具有脂质双层膜结构，其膜表面高表达四跨膜蛋白(例如：CD9、CD81和CD63)。细胞外囊泡在细胞间通讯中具有重要作用，参与了一系列生理与病理过程的调节。
[0004]适配体信标是一种由荧光基团和淬灭基团共同修饰的寡核苷酸链，荧光基团修饰适配体，淬灭基团修饰适配体的互补链。当不存在靶标蛋白时，适配体与互补链结合在一起，荧光被淬灭。当存在靶标蛋白时，靶标蛋白与适配体结合，荧光基团与淬灭基团远离，在激发光的激发下，适配体信标会标发出荧光。
[0005]现有技术中能够实现单细胞分泌物动态检测通常需要能够执行单细胞分离和随后的实时分泌物检测的高度集成的系统，研究开发一种无需复杂设备、操作简单方便的原位、动态检测细胞分泌蛋白的方法成为当前亟待研究的重要课题。

技术实现思路

[0006]鉴于此，本专利技术的目的是提供一种原位、动态检测细胞分泌蛋白的方法，该方法通过将单细胞和适配体信标封装在油包水液滴中，可以随时间推移，检测液滴中单个细胞分泌的蛋白质，该方法不需要复杂的微流控设备和有经验的操作人员，可以大范围推广使用。
[0007]本专利技术目的是通过以下方式实现：
[0008]本专利技术提供一种原位、动态检测细胞分泌蛋白的方法，所述方法为将单细胞和分泌蛋白检测试剂封装在通过涡旋震荡生成的油包水液滴中，所述的分泌蛋白检测试剂为荧光基团修饰的分泌蛋白适配体和淬灭基团修饰的适配体互补链杂交形成的适配体信标，培
养细胞一段时间，通过检测荧光强度来分析细胞实时分泌蛋白情况。
[0009]基于上述技术方案，进一步地，所述的分泌蛋白包括但不限于细胞因子、细胞外囊泡表面的跨膜蛋白。
[0010]基于上述技术方案，进一步地，所述的细胞因子包括IFN
‑
γ、IL
‑
6、TNF
‑
α，细胞外囊泡表面的跨膜蛋白包括
CD9+
EV、
CD63+
EV和
CD81+
EV。
[0011]基于上述技术方案，进一步地，IFN
‑
γ的适配体信标为
[0012]5’‑6‑
FAM
‑
TGGGGTTGGTTGTGTTGGGTGTTGTGT
‑3’
和
[0013]5’‑
ACAACCAACCCCA
‑
BHQ
‑1‑3’
。
[0014]基于上述技术方案，进一步地，IL
‑
6的适配体信标为
[0015]5’‑
GGTGGCAGGAGGACTATTTATTTGCTTTTC
‑
Pacific Blue
‑3’
和
[0016]5’‑
Dabcy
‑
ACAACCAACCCCA
‑3’
。
[0017]基于上述技术方案，进一步地，TNF
‑
α的适配体信标为
[0018]5’‑
Cy5
‑
TGGTGGATGGCGCAGTCGGCGACAA
‑3’
和
[0019]5’‑
ACAACCAACCCCA
‑
BHQ
‑3‑3’
。
[0020]基于上述技术方案，进一步地，
CD63+
EV的适配体信标为
[0021]5’‑6‑
FAM
‑
CACCCCACCTCGCTCCCGTGACACTAATGCTA
‑3’
和
[0022]5’‑
GAGCGAGGTGGGGTG
‑
BHQ
‑1‑3’
。
[0023]基于上述技术方案，进一步地，所述方法包括以下步骤：
[0024](1)配制含有所述适配体信标的单细胞悬液，然后滴加到含表面活性剂的氟化油中；
[0025](2)将步骤(1)得到的混合溶液在涡旋仪上涡旋震荡，得到封装有单细胞和适配体信标的油包水液滴；
[0026](3)将步骤(2)得到的油包水液滴于培养箱中孵育，间隔一段时间取出适量液滴，用荧光显微镜检测液滴的荧光强度，得到细胞实时分泌蛋白情况。
[0027]基于上述技术方案，进一步地，步骤(1)中单细胞悬液中细胞个数为100～1
×
106个，单细胞悬液的浓度为1
×
103～5x107个/mL。
[0028]基于上述技术方案，进一步地，步骤(1)中所述适配体信标在单细胞悬液中的浓度为0.1～100μM。
[0029]基于上述技术方案，进一步地，步骤(1)中含表面活性剂的氟化油中的表面活性剂为全氟聚醚基表面活性剂，包括008
‑
表面活性剂和FS
‑
surf
‑
表面活性剂，表面活性剂的含量为1～10wt％。基于上述技术方案，进一步地，步骤(1)中单细胞悬液与含表面活性剂的氟化油的体积比为1:10～1:2。
[0030]基于上述技术方案，进一步地，步骤(2)中涡旋震荡的条件为涡旋速度为1500～3000rpm，涡旋时间为20～60s。
[0031]基于上述技术方案，进一步地，步骤(3)中培养条件为37℃，5％ CO2条件下培养。
[0032]基于上述技术方案，进本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种原位、动态检测细胞分泌蛋白的方法，其特征在于，所述方法为将单细胞和分泌蛋白检测试剂封装在油包水液滴中，所述的分泌蛋白检测试剂为荧光基团修饰的分泌蛋白适配体和淬灭基团修饰的适配体互补链杂交形成的适配体信标，培养细胞一段时间，通过检测荧光强度来分析细胞实时分泌蛋白情况。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的油包水液滴通过涡旋震荡生成。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的分泌蛋白包括但不限于细胞因子、细胞外囊泡表面的跨膜蛋白。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的细胞因子包括IFN
‑
γ、IL
‑
6、TNF
‑
α，细胞外囊泡表面的跨膜蛋白包括
CD9+
EV、
CD63+
EV和
CD81+
EV。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)配制含有所述适配体信标的单细胞悬液，然后滴加到含表面活性剂的氟化油中；(2)将步骤(1)得到的混合溶液在涡旋仪上涡旋震荡，得到封装有单细胞和适配体信标的油...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆瑶，朱凤佼，白雪，李斌，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：