一种双光子检测羧酸酯酶的荧光探针、制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种双光子检测CE的荧光探针、制备、筛选及应用，属于合成与检测技术领域。所述荧光探针的结构式如下：其中，R1为H，R2为H；或，R1为H，R2为F；或，R1为F，R2为H。荧光探针通过7

【技术实现步骤摘要】
为F的荧光探针P2的荧光响应倍数高、响应迅速以及探针本身稳定性好。荧光探针P2能够与CE反应并呈现荧光信号变化，具有高选择性、高灵敏度及响应时间快等优点。
[0013]本专利技术的第二个方面，提供上述的一种双光子检测羧酸酯酶的荧光探针的制备方法，制备路线如下：
[0014][0015]包括如下步骤：
[0016]将7
‑
氨基
‑4‑
甲基香豆素和氟和/或氯取代的乙酰氯溶于有机溶剂中，加入三乙胺后在0℃下反应3.5～4.5h，反应完毕即得双光子检测羧酸酯酶的荧光探针。
[0017]当氟和/或氯取代的乙酰氯为氯乙酰氯时，得到荧光探针P1。
[0018]当氟和/或氯取代的乙酰氯为氯(氟)乙酰氯时，得到荧光探针P2。所述氯(氟)乙酰氯结构式如下：
[0019][0020]当氟和/或氯取代的乙酰氯为氯二氟乙酰氯时，得到荧光探针P3。所述氯二氟乙酰氯结构式如下：
[0021][0022]本专利技术的一些实施例中，7
‑
氨基
‑4‑
甲基香豆素、氟和/或氯取代的乙酰氯、三乙胺的摩尔比为1:1.8～2.2:7。
[0023]优选的，7
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氨基
‑4‑
甲基香豆素、氟和/或氯取代的乙酰氯、三乙胺的摩尔比为1:1.9～2.1:7。
[0024]本专利技术的一些实施例中，所述有机溶剂包括四氢呋喃，所述有机溶剂中，7
‑
氨基
‑4‑
甲基香豆素的浓度为0.08～0.12mmol/mL。
[0025]优选的，7
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氨基
‑4‑
甲基香豆素的浓度为0.09～0.11mmol/mL。
[0026]本专利技术的一些实施例中，反应完毕，将反应混合液旋干后，分离提纯，得到双光子检测羧酸酯酶的荧光探针。
[0027]优选的，通过硅胶柱层析的方法分离提纯产品，分离提纯的试剂为石油醚和乙酸乙酯；进一步优选的，石油醚和乙酸乙酯的体积比为8～12：1。
[0028]本专利技术的第三个方面，提供上述的一种双光子检测羧酸酯酶的荧光探针在检测羧酸酯酶中的应用。
[0029]本专利技术的第四个方面，提供一种检测羧酸酯酶的方法，采用上述的一种双光子检测羧酸酯酶的荧光探针，包括如下步骤：
[0030]向待测样样品中加入所述荧光探针，在35～40℃下孵育25～35min，在双光子共聚焦显微镜下进行细胞成像；激发波长为720nm，蓝色通道波长收集范围为400至490nm；
[0031]所述方法不以疾病的诊断为目的。
[0032]本专利技术的一些实施例中，在37℃下孵育30min。
[0033]本专利技术的一些实施例中，所述荧光探针在待测样品中的浓度为8～12μM。
[0034]本专利技术的有益效果为：
[0035]本专利技术以7
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氨基
‑4‑
甲基香豆素作为荧光母体，以不同氟取代的氯乙酰基作为CE的识别位点，设计合成三种荧光探针。最终选择了荧光响应倍数高、响应迅速以及探针本身稳定性好的荧光探针P2进行后续应用。荧光探针P2能够与CE反应断裂酰胺键，ICT效应消失，导致荧光增强。荧光探针P2结构简单，在445nm处的荧光增强41倍，且在445nm处的荧光强度在30min左右到达反应平台；可以在生理环境下检测CE，能够与CE反应并呈现荧光信号变化，应用于检测CE时，具有高选择性、高灵敏度及响应时间快等优点。
附图说明
[0036]构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。
[0037]图1是本专利技术三种小分子荧光探针P与CE反应时的吸收光谱谱图，横坐标为波长(nm)，纵坐标为吸光度；
[0038]图2是本专利技术三种小分子探针P与CE反应时的荧光响应光谱图，横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度；
[0039]图3是本专利技术三种小分子荧光探针P与CE响应的动力学实验，横坐标为时间，纵坐标为荧光强度；
[0040]图4是本专利技术小分子荧光探针P2对不同浓度的CE的荧光响应光谱图，探针的激发波长为350nm，横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度；
[0041]图5是本专利技术小分子荧光探针P2在不同pH环境中对CE的响应，探针的激发波长为350nm，横坐标为pH值，纵坐标为445nm波长处的荧光强度；
[0042]图6是本专利技术小分子荧光探针P2对CE的选择性实验，探针的激发波长为350nm，横坐标为探针空白、干扰物及待测物，纵坐标为445nm波长处的荧光强度；
[0043]图7是本专利技术小分子荧光探针P2对CE的选择性实验，探针的激发波长为350nm，横坐标为探针空白、干扰物及待测物，纵坐标为445nm波长处的荧光强度；
[0044]图8是本专利技术小分子荧光探针P2对CE的选择性实验，探针的激发波长为350nm，横坐标为探针空白、干扰物及待测物，纵坐标为445nm波长处的荧光强度；
[0045]图9是本专利技术小分子荧光探针P2与CE反应机理的质谱表征；
[0046]图10是本专利技术小分子荧光探针P2与CE反应机理的高效液相色谱表征，横坐标为保留时间；
[0047]图11是本专利技术小分子荧光探针P2与CE反应的机理示意图；
[0048]图12是本专利技术小分子荧光探针P2检测人正常肝细胞外源性CE的双光子共聚焦成像图；
[0049]图13是本专利技术小分子荧光探针P2检测人正常肝细胞和人肝癌细胞内源性CE的双光子共聚焦成像图。
具体实施方式
[0050]为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本专利技术的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本专利技术的技术方案。
[0051]以下实施例中采用的氯乙酰氯、氯(氟)乙酰氯、氯二氟乙酰氯可以是市售产品，也可以自行合成。
[0052]例如：氯(氟)乙酰氯可采用专利US04122115Preparation of chloro
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and bromo
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fluoroacetyl chloride公开的方法进行制备，采用氯氟乙酸乙酯与氯磺酸在120℃～200℃下反应生成氯氟乙酰氯，合成路线如下：
[0053][0054]或，采用氯氟乙酸乙酯、氯磺酸和邻苯二甲酰氯在120℃～200℃下反应生成氯氟乙酰氯，合成路线如下：
[0055][0056]例如：氯二氟乙酰氯可采用Zard S S Z.A Practical Source of Chlorodifluoromethyl Radicals.Convergent Routes to gem
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Difluoroalkenes and
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dienes and(2,2
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Difluoroethyl)
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indoles,
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双光子检测羧酸酯酶的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的结构式如下：其中，R1为H，R2为H；或，R1为H，R2为F；或，R1为F，R2为F。2.如权利要求1所述的一种双光子检测羧酸酯酶的荧光探针，其特征在于，R1为H，R2为F。3.如权利要求1所述的一种双光子检测羧酸酯酶的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将7
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氨基
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甲基香豆素和氟和/或氯取代的乙酰氯溶于有机溶剂中，加入三乙胺后在0℃下反应3.5～4.5h，反应完毕即得双光子检测羧酸酯酶的荧光探针；所述氟和/或氯取代的乙酰氯为氯乙酰氯、氯(氟)乙酰氯和氯二氟乙酰氯中的一种。4.如权利要求3所述的一种双光子检测羧酸酯酶的荧光探针的制备方法，其特征在于，7
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氨基
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甲基香豆素、氟和/或氯取代的乙酰氯、三乙胺的摩尔比为1:1.8～2.2:7。5.如权利要求4所述的一种双光子检测羧酸酯酶的荧光探针的制备方法，其特征在于，7
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氨基
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甲基香豆素、氟和/或氯取代的乙酰氯、三乙胺的摩尔比为1:1.9～2.1:7。6.如权利要求3所述的一种双光子检测羧酸酯酶的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂包括四氢呋喃，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐波，王栩，张建，王玉成，焦晓云，李勇，解希雷，
申请(专利权)人：山东师范大学，
类型：发明
国别省市：