一种芽孢杆菌信号分子AI-2及其体外合成方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种芽孢杆菌信号分子AI

【技术实现步骤摘要】
一种芽孢杆菌信号分子AI
‑
2及其体外合成方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物防治
，具体是一种芽孢杆菌信号分子AI
‑
2及其体外合成方法和应用。

技术介绍

[0002]生物防治被定义为“使用有生命的生物体降低特定的有害物种的种群密度或抑制其影响，使其数量减少或破坏性降低”。目前，芽孢杆菌、酵母菌和放线菌等生防菌已被研究对采后果品的病害防治有着积极的作用。解淀粉芽孢杆菌是一种理想的生物防治细菌，它属于革兰氏阳性菌，具有稳定性好、抗逆性强、生长繁殖速度快等优点，对炭疽菌、灰霉属和丁香假单胞菌等多种真菌和细菌具有良好的抗菌活性。
[0003]但是，生防菌对于采后果品腐败菌病原菌的控制效力与传统杀菌剂相比还是存在一定的差距，主要原因为生防菌的生防效力受腐败病原菌的浓度、采后果品的衰老程度和贮藏条件等多种因素的影响。因此，采取合适的手段提高生防菌的生防效果就显得尤其重要。目前已经报道可以提高酵母生防效力的物质主要有水杨酸、细胞分裂素、吲哚
‑3‑
乙酸、赤霉素、氯化钙、壳聚糖、N
‑
乙酰氨基葡萄糖等。但是基于信号分子AI
‑
2的添加来提高芽孢杆菌生防效力的方法还未见报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种芽孢杆菌信号分子AI
‑
2及其体外合成方法和应用本专利技术通过添加体外合成的信号分子AI
‑
2可以显著提高B4对采后果品病原菌扩展青霉菌的体外和体内的抑制能力，降低采后果品在贮藏期间的发病率，该方法安全无害，这为生防菌应用于采后果品防霉保鲜提供了新的思路。
[0005]本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0006]一方面，本专利技术提供了一种芽孢杆菌信号分子AI
‑
2的体外合成方法，其包括如下步骤：
[0007]1)将解淀粉芽孢杆菌B4(Bacillus amyloliquefaciens B4)的luxS基因和mtnN基因分别克隆到表达载体pET
‑
30a，转化到大肠杆菌BL21中，获得阳性重组表达菌BL21
‑
pET
‑
30a
‑
luxS和BL21
‑
pET
‑
30a
‑
mtnN；
[0008]2)将阳性重组表达菌BL21
‑
pET
‑
30a
‑
luxS和BL21
‑
pET
‑
30a
‑
mtnN分别进行活化培养，将培养好的阳性重组表达菌分别进行裂解，经离心后分离分别得到LuxS蛋白上清和MtnN蛋白上清；
[0009]3)用磷酸钠缓冲液稀释S
‑
腺苷高半胱氨酸，将其分别加入到LuxS蛋白上清和MtnN蛋白上清中进行反应，反应后的两种反应液再混合在一起进行反应，反应结束后，将最终反应液进行分次超滤，并将超滤后的滤液用0.22μm的无菌滤膜过滤除菌，得到AI
‑
2信号分子。
[0010]第二方面，本专利技术提供了一种含AI
‑
2信号分子，其采用上述的方法合成得到。
[0011]第三方面，本专利技术还提供了一种含AI
‑
2信号分子菌悬液，其采用如下方法制备：
[0012]将解淀粉芽孢杆菌B4(Bacillus amyloliquefaciens B4)接种于LB液体培养基中，培养至OD595为0.55，然后将菌液离心，去除上清液，留菌体沉淀，并将菌体沉淀用相同体积的LB液体培养基进行重悬，得B4菌悬液；
[0013]将前述方法得到的AI
‑
2信号分子加入到浓度为7
‑
9lg CFU/mL的所述B4菌悬液中，得到含AI
‑
2信号分子菌悬液；菌悬液中，AI
‑
2信号分子的浓度为10
‑
70μmol/L。
[0014]第四方面，本专利技术提供了所述的含AI
‑
2信号分子菌悬液在抑制采后果品腐败病原菌生长中的应用，所述采后果品腐败病原菌为扩展青霉。
[0015]与现有技术相比，本专利技术通过添加体外合成的信号分子AI
‑
2可以显著提高B4对采后果品病原菌扩展青霉菌的体外和体内的抑制能力，降低采后果品在贮藏期间的发病率，该方法安全无害。外源性的添加AI
‑
2信号分子对B4的生长趋势没有显著地影响。本体外，添加本专利技术AI
‑
2信号分子的B4菌悬液对扩展青霉的抑制效果增强；在体内，本专利技术添加AI
‑
2信号分子的B4菌悬液可以有效地的抑制梨和枇杷上腐败菌扩展青霉的生长，同时调节果品表面菌群，降低果实的发病率。因此，本专利技术制备的AI
‑
2信号分子可以显著增加B4对扩展青霉菌在果品体内和体外的抑制效果，高效实用。
附图说明
[0016]图1芽孢杆菌B4的LuxS与MtnN蛋白异源表达的电泳结果；
[0017]图2不同浓度的AI
‑
2对B4菌株游离细胞和生物膜生物量的影响：(A)游离细胞(B)生物膜；
[0018]图3不同浓度的AI
‑
2作用下B4在体外对扩展青霉菌抑制作用的影响；
[0019]图4不同浓度的AI
‑
2作用下B4对梨果实病斑直径的抑制效果；
[0020]图5不同浓度的AI
‑
2作用下B4对枇杷果实病斑直径的抑制效果。
具体实施方式
[0021]下面对本专利技术的实施例作详细说明，但下述的实施例不用来限制本专利技术的保护范围。
[0022]实例1：芽孢杆菌B4的AI
‑
2信号分子的异源表达与高效合成
[0023]根据解淀粉芽孢杆菌B4的luxS和mtnN基因设计引物，交予生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。PCR引物的设计如下：luxS
‑
F(SEQ ID No.1)：5
’
CCCAAGCTTGCATGCCTTCAGTAGAAAGTT 3
’
(划线部分HindIII酶切位点)、luxS
‑
R(SEQ ID No.2)：5
’
CCGCTCGAGGTTATCCGAACACTTTCAGCAA 3
’
(划线部分XhoI酶切位点)、mtnN
‑
F(SEQ ID No.3)：5
’
CCCAAGCTTGCATGAAACTGGCAGTCAT 3
’
(划线部分HindIII酶切位点)和mtnN
‑
R(SEQ ID No.4)：5
’
CCGCTCGAGGTTAGTGAATTCGTT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种芽孢杆菌信号分子AI
‑
2的体外合成方法，其特征在于，包括如下步骤：1)将解淀粉芽孢杆菌B4(Bacillus amyloliquefaciens B4)的luxS基因和mtnN基因分别克隆到表达载体pET
‑
30a，转化到大肠杆菌BL21中，获得阳性重组表达菌BL21
‑
pET
‑
30a
‑
luxS和BL21
‑
pET
‑
30a
‑
mtnN；2)将阳性重组表达菌BL21
‑
pET
‑
30a
‑
luxS和BL21
‑
pET
‑
30a
‑
mtnN分别进行活化培养，将培养好的阳性重组表达菌分别进行裂解，经离心后分离分别得到LuxS蛋白上清和MtnN蛋白上清；3)用磷酸钠缓冲液稀释S
‑
腺苷高半胱氨酸，将其分别加入到LuxS蛋白上清和MtnN蛋白上清中进行反应，反应后的两种反应液再混合在一起进行反应，反应结束后，将最终反应液进行分次超滤，并将超滤后的滤液用0.22μm的无菌滤膜过滤除菌，得到AI
‑
2信号分子。2.根据权利要求1所述的体外合成方法，其特征在于，所述步骤2)的活化培养为：将阳性重组表达菌接种于LB
‑
Kana固体培养基中复苏，之后LB
‑
Kana液体培养基中活化二代；LB
‑
Kana液体培养基中，35℃
‑
37℃、180rpm
‑
220rpm培养至OD600为0.6，此时加入工作浓度为0.2
‑
0.3mmol/L的IPTG溶液，于26℃
‑
30℃、150
‑
180rpm诱导表达18
‑
20h。3.根据权利要求2所述的体外合成方法，其特征在于，所述步骤2)中，将培养好的阳性重组表达菌分别进行裂解为：诱导结束后将菌液在5000g～8000g室温条件下离心4
‑
10min，收集菌体后用无菌的PBS缓冲液洗涤菌体，最后加入PBS缓冲液重悬菌体于
‑
80℃过夜冻存以便菌体破裂；将菌体于室温解冻后用超声破碎仪裂解，破碎程序设定为：180W
‑
220W，3
‑
5s工作，3
‑
5s...

【专利技术属性】
技术研发人员：周文文，孙晋跃，聂麟杰，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：