一种试剂盒及一种核酸提取方法技术

本发明专利技术公开了一种试剂盒及一种核酸提取方法，该试剂盒用于核酸样本提取，该试剂盒包括过氧化氢溶液，该过氧化氢溶液的摩尔浓度为0.1

【技术实现步骤摘要】
一种试剂盒及一种核酸提取方法


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种试剂盒及一种核酸提取方法。

技术介绍

[0002]全基因组测序(WGS)可以研究结核分枝杆菌(Mtb)的整个基因组，研究时使用的样本多为痰液样本，由于痰液样本具有粘稠度高、黏蛋白多、不易液化、容易成团结块等特点，痰液样本的核酸检测常规至少需要经历3步处理过程：痰液液化、细胞裂解以及核酸抽提。
[0003]常规痰液液化处理过程主要存在以下不足：(1)单独的痰液液化过程由于要求保存细胞的完整性而不添加强变性剂，故极易造成样本中的RNA被RNA酶催化降解，从而导致样本核酸损失；(2)常规的痰液液化常用巯基类试剂，且加入的试剂体积多为5
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10倍痰液体积，导致最终的样品体积较大，从而极易发生核酸降解和损失；(3)操作过程较为复杂耗时：所使用的处理方法有氢氧化钠法、DTT(二硫苏糖醇)法以及蛋白酶法。氢氧化钠法是最常用的痰液液化方法，该方法比较简单，利用主成分为一定浓度的氢氧化钠溶液在60
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80℃(也可在室温条件下)液化痰液，该方法用于核酸检测时其强碱性环境易造成核酸损失。DTT(二硫苏糖醇)法的原来是利用含巯基(
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SH)的DTT(二硫苏糖醇)断裂痰液中导致粘稠的主要成分粘蛋白，以PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液)提供生理缓冲，通常还会加入乙醇等试剂来固定细胞。该方法使用的DTT(二硫苏糖醇)成本较高，且该方法易造成RNA损失，不适合大批量处理临床痰液样本。蛋白酶法的原理是利用蛋白酶消化痰液黏蛋白，该方法的酶解反应耗时较长，所需蛋白酶成本较高，且黏蛋白消化效率低。

技术实现思路

[0004]为了减少粘稠样本，如痰液样本、唾液样本或脓液样本的核酸提取过程中的核酸损失，提高核酸提取效率和核酸提取得率，本专利技术的实施方式提供一种试剂盒及一种核酸提取方法。
[0005]第一方面，本专利技术提供一种试剂盒，该试剂盒用于核酸样本提取，该试剂盒包括过氧化氢溶液，该过氧化氢溶液的摩尔浓度为0.1
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2mol/L。对于某些核酸样本，其中含有的菌体被粘液或黏蛋白等物质包裹，难以释放，加入过氧化氢溶液后，菌体中的物质与过氧化氢反应产生气体，生成的气泡可以破坏粘液或块状的样本，使其完全液化，从而释放被粘液或黏蛋白等物质包裹住的菌体，使得后续的核酸提取步骤得以顺利进行。并且，由于过氧化氢溶液的反应较为温和，基本不会破坏细胞的完整性，相较于使用强碱等物质进行液化的方法，能够减少核酸损失，提高核酸得率。
[0006]在一个示例中，过氧化氢溶液的摩尔浓度为0.3
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1mol/L。
[0007]在一个示例中，试剂盒还包括裂解液。
[0008]在一个示例中，裂解液包括第一表面活性剂。
[0009]在一些示例中，第一表面活性剂在裂解液中的质量浓度为0.1％
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10％。
[0010]较佳地，第一表面活性剂为离子型表面活性剂。
[0011]任选地，第一表面活性剂为苯扎溴铵、十二烷基硫酸钠或十六烷基三甲基溴化铵中的至少一种。
[0012]在一个示例中，裂解液还包括蛋白质变性剂。
[0013]任选地，蛋白质变性剂为异硫氰酸胍、盐酸胍、重金属盐或尿素中的至少一种。
[0014]在一些示例中，裂解液还包括蛋白酶。
[0015]较佳地，蛋白酶为蛋白酶K。
[0016]在一些示例中，试剂盒还包括第一洗液。
[0017]在一个示例中，第一洗液中包括第二表面活性剂。
[0018]在一些示例中，第二表面活性剂在所述第一洗液中的质量浓度为0.1％
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6％。
[0019]任选地，第二表面活性剂为苯扎溴铵、聚乙二醇辛基苯基醚、十二烷基硫酸钠或十六烷基三甲基溴化铵中的至少一种。
[0020]在一些示例中，试剂盒还包括第二洗液。
[0021]在一个示例中，第二洗液包含乙醇。
[0022]在一些示例中，试剂盒还包括预处理试剂。
[0023]较佳地，预处理试剂的使用浓度为1
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3mg/mL。
[0024]较佳地，预处理试剂包括溶菌酶。
[0025]较佳地，预处理试剂还包括金属离子螯合剂。
[0026]任选地，金属离子螯合剂为乙二胺四乙酸、氨基三乙酸或二亚乙基三胺五乙酸中的至少一种。
[0027]在一个示例中，试剂盒还包括沉淀剂。
[0028]较佳地，沉淀剂为异丙醇。
[0029]在一些示例中，所述核酸样本为痰液样本、唾液样本或脓液样本。
[0030]在另一些示例中，所述核酸样本含有菌体核酸。
[0031]在另一些示例中，所述核酸样本含有过氧化氢酶。
[0032]另一方面，本专利技术提供一种核酸提取方法，包括步骤一：将上述试剂盒中的过氧化氢溶液与核酸样本进行混合，提取所述核酸样本中的核酸。
[0033]在一些示例中，过氧化氢溶液与样本混合的时间为0.1～10min。
[0034]在一些示例中，该方法还包括步骤二：将预处理试剂与所述样本混合。
[0035]在一些示例中，该方法还包括步骤三：将裂解液与经过步骤二处理的所述样本混合。
[0036]在一些示例中，该方法还包括步骤四：将沉淀剂与经过步骤三处理的所述样本混合。
[0037]在一些示例中，该方法还包括步骤五：将第一洗液与经过步骤四处理的所述样本混合。
[0038]在一些示例中，该方法还包括步骤六：将第二洗液与经过步骤五处理所述样本混合。
[0039]本专利技术的核酸提取方法，使用过氧化氢溶液液化样本，能够在更短的时间内更温和地液化样本，减少核酸损失，提高核酸提取效率；改进后的裂解液能够更好地裂解样本中的菌体以及分离蛋白质和核酸，进一步减少核酸损失，改进后的第一洗液能够更好地除去
杂质，提高提取的核酸的纯度。
附图说明
[0040]本专利技术实施方式的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施方式的描述中将变得明显和容易理解，其中：
[0041]图1为实施例1中核酸样本1和核酸样本2的琼脂糖凝胶电泳结果；
[0042]图2为实施例2中各组提取到的细菌核酸(gDNA)的琼脂糖凝胶电泳结果。
具体实施方式
[0043]下面详细描述本专利技术的实施方式。本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例，下面通过参考附图描述的实施方式是示例性的，仅用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。
[0044]除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0045]目前对于粘稠样本，如痰液样本、唾液样本和脓液样本等，在进行核酸提取前需要对此类样本进行液化预处理，常采用氢氧化钠法，该方法主要是利用主成分为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于核酸样本提取，所述试剂盒包括过氧化氢溶液，所述过氧化氢溶液的摩尔浓度为0.1
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2mol/L，任选地，所述过氧化氢溶液的摩尔浓度为0.3
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1mol/L。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括裂解液。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述裂解液包括第一表面活性剂，任选地，所述第一表面活性剂在所述裂解液中的质量浓度为0.1％
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10％；任选地，所述第一表面活性剂为离子型表面活性剂；任选地，所述第一表面活性剂为苯扎溴铵、十二烷基硫酸钠或十六烷基三甲基溴化铵中的至少一种。4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述裂解液还包括蛋白质变性剂，任选地，所述蛋白质变性剂为异硫氰酸胍、盐酸胍、重金属盐或尿素中的至少一种；任选地，所述裂解液还包括蛋白酶；任选地，所述蛋白酶为蛋白酶K。5.根据权利要求1
‑
4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第一洗液，任选地，所述第一洗液包括第二表面活性剂；任选地，所述第二表面活性剂在所述第一洗液中的质量浓度为0.1％
‑
6％；任选地，所述第二表面活性剂为苯扎溴铵、聚乙二醇辛基苯基醚、十二烷基硫酸钠或十六烷基三甲基溴化铵中的至少一种。6.根据权利要求1
‑
5任一项所述的试剂盒，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：鞠明霞，康欢欢，高一凡，周乐天，曾立董，张国良，毕静，
申请(专利权)人：深圳市真迈生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：