多基因不同突变频率参考品及其制备方法与应用技术

本发明专利技术属于基因检测技术领域，具体涉及一种多基因不同突变频率参考品及其制备方法与应用。该制备方法包括步骤：S1：提取包含目标基因的阳性和阴性样本基因组DNA；S2：获取阳性和阴性样本基因组DNA中目标基因的拷贝数并结合参考品目标突变频率与目标质量构建多元方程计算得出各样本的混合比例用以制备目标突变参考品。本申请尤其适用于多基因不同突变频率参考品制备，基于基因拷贝数的绝对定量，通过控制混合过程中各样本的添加量精确控制混合体系中各基因的拷贝数，具有快速准确且经济的特点；且稀释后的参考品无需再进行数字PCR或者NGS定量确认，提高生产效率的同时节约了成本，更具经济效益。更具经济效益。

【技术实现步骤摘要】
多基因不同突变频率参考品及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于基因检测
，具体涉及一种多基因不同突变频率参考品及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]近年来，基因检测领域发展迅速，在包括肿瘤的早筛早诊、辅助诊断、靶向用药、及动态监测等方面得到广泛的应用。基因检测可以为临床医生提供更多、更精准的诊断和治疗的信息，有助于患者的个体化治疗，提高疗效的同时，降低因此产生的毒副作用。目前基因检测主要的方法包括基因芯片、ARMS PCR、数字PCR、高通量测序技术(NGS)等。而由于NGS能够同时对上百万甚至数十亿个DNA分子进行测序，实现了大规模、高通量测序的目标，在肿瘤基因检测应用中占比越来越重。
[0003]在基于临床的基因检测类体外诊断试剂盒开发、注册以及后续生产过程中，需要经常用到包括多种不同的靶基因突变且突变频率不同的参考品，用于开发过程的性能验证，注册过程的验证确认以及生产过程中的质量控制。
[0004]由于NGS类诊断试剂盒检测通量大，涉及到的检测基因种类比较多，能够检测的基因突变频率范围比较宽，相应的使用到的参考品包含的基因种类就比较多。而每个基因种类和每个突变频率都设置单独对应的参考品会导致参考品数量庞大，在实际应用过程中操作繁琐且会导致检测试剂的浪费。理想的做法是将不同基因突变的临床样本或者细胞系样本混合，制备成含有多种基因且突变频率不同的参考品，这样就可以通过一次检测反应同时可以检测出多个要考察的基因突变。
[0005]然而在实际操作过程中发现由于样本类型、来源、制备和保存等各方面的差异，再加上检测过程中所用引物探针和反应体系之间的不同，不同样本对同一基因或者同一样本对不同基因测得的拷贝数存在不同程度的差异，这就导致即使等质量样本在混合过程中每个样本在混合体系中贡献的拷贝数不尽相同，所以制备多基因不同频率参考品无法通过简单的按照突变比例倍数稀释得到。举例来说，如果将靶基因突变比例20％的突变型基因组DNA与相同质量浓度的野生型基因组DNA按1∶1的体积比例混合，得到的往往不是靶基因突变比例10％的参考品。
[0006]为了得到所需靶基因突变比例的参考品，常规做法是：
[0007]将含有较高突变比例的阳性基因组DNA与野生型基因组DNA按照不同比例混合，再将制备得到的参考品梯度稀释，然后对这一系列梯度稀释的参考品进行突变比例的测定(通过数字PCR、高通量测序等)，并与目标突变频率进行比较，最后得到突变比例符合需求的参考品。
[0008]采用常规方法制备参考品一般需要使用梯度稀释的方法或者制定标准曲线的方法，过程繁琐，需要多个系列梯度稀释，耗时耗力；为了得到准确的突变频率，需要多次使用数字PCR或高通量测序进行定量，制备周期长且成本较高；现有梯度稀释或者制定标准曲线的方法往往只能制备较少基因种类和突变频率的参考品，对于制备多基因不同突变频率的
参考品时，由于要满足多基因不同的突变频率的需求，操作就更加繁琐，结果往往偏差较大，很难达到多个基因不同突变频率的平衡，所以无法再通过梯度稀释或制作标准曲线的方法稀释得到。

技术实现思路

[0009]在一方面，本专利技术提供一种多基因不同突变频率参考品的制备方法，基于基因拷贝数的绝对定量，通过控制混合过程中各样本的添加量精确控制混合体系中目标基因对应的拷贝数，从而快速、简便且准确地制备多基因不同突变频率参考品。所采用技术方案如下：
[0010]一种多基因不同突变频率参考品的制备方法，包括步骤：
[0011]S1：提取包含目标基因的阳性和阴性样本基因组DNA；
[0012]S2：获取阳性和阴性样本基因组DNA中目标基因的拷贝数并结合参考品目标突变频率与目标质量构建多元方程计算得出各样本的混合比例用以制备目标突变参考品。
[0013]在一些实施方案中，所述步骤S2具体为：
[0014]S21：取适量阳性样本基因组DNA，测定目标基因的突变拷贝数MU
a
和野生拷贝数WT
a
；S22：取适量阴性样本基因组DNA，测定目标基因的突变拷贝数MU
b
和野生拷贝数WT
b
；S23：构建多元方程计算制备目标突变参考品所需各样本的混合比例，所述多元方程为：X+Y＝N；X*MU
a
/(X*MU
a
+X*WT
a
+Y*MU
b
+Y*WT
b
)＝n；其中，N为参考品目标质量；n为参考品目标突变频率；X，Y分别为制备目标突变参考品所需阳性和阴性样本质量。
[0015]在一些实施方案中，制备目标突变参考品所需包含不同目标基因的多个阳性样本质量定义为X1，X2…
X
n
，包含目标基因的阴性样本质量定义为Y，阳性样本基因组DNA测定目标基因的突变拷贝数为MU
a1
，MU
a2
…
MU
an
和野生拷贝数为WT
a1
，WT
a2
…
WT
an
，所构建的多元方程如下：
[0016]X1+X2+
…
X
n
+Y＝N；
[0017](X1*MU
a1
)/(X1*MU
a1
+X1*WT
a1
+X2*MU
a2
+X2*WT
a2
+
…
X
n
*MU
an
+X
n
*WT
an
+Y*MU
b
+Y*WT
b
)＝n1；
[0018](X2*MU
a2
)/(X1*MU
a1
+X1*WT
a1
+X2*MU
a2
+X2*WT
a2
+
…
X
n
*MU
an
+X
n
*WT
an
+Y*MU
b
+Y*WT
b
)＝n2；
[0019]…
[0020](X
n
*MU
an
)/(X1*MU
a1
+X1*WT
a1
+X2*MU
a2
+X2*WT
a2
+
…
X
n
*MU
an
+X
n
*WT
an
+Y*MU
b
+Y*WT
b
)＝n
n
；
[0021]需要说明的是，前述式中各突变拷贝数与野生拷贝数的具体数值对应其等式中各频率对应目标基因的绝对计数，即各等式之间的突变拷贝数与野生拷贝数不一定相等。
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多基因不同突变频率参考品的制备方法，其特征在于，包括步骤：S1：提取包含目标基因的阳性和阴性样本基因组DNA；S2：获取阳性和阴性样本基因组DNA中目标基因的拷贝数并结合参考品目标突变频率与目标质量构建多元方程计算得出各样本的混合比例用以制备目标突变参考品。2.根据权利要求1所述的一种多基因不同突变频率参考品的制备方法，其特征在于，所述步骤S2包括：S21：取适量阳性样本基因组DNA，测定目标基因的突变拷贝数MU
a
和野生拷贝数WT
a
；S22：取适量阴性样本基因组DNA，测定目标基因的突变拷贝数MU
b
和野生拷贝数WT
b
；S23：构建多元方程计算制备目标突变参考品所需各样本的混合比例，所述多元方程为：X+Y＝N；X*MU
a
/(X*MU
a
+X*WT
a
+Y*MU
b
+Y*WT
b
)＝n；其中，N为参考品目标质量；n为参考品目标突变频率；X，Y分别为制备目标突变参考品所需阳性和阴性样本质量。3.根据权利要求2所述的一种多基因不同突变频率参考品的制备方法，其特征在于，制备目标突变参考品所需包含不同目标基因的多个阳性样本质量定义为X1，X2…
X
n
，包含目标基因的阴性样本质量定义为Y，阳性样本基因组DNA测定目标基因的突变拷贝数为MU
a1
，MU
a2
…
MU
an
和野生拷贝数为WT
a1
，WT
a2
…
WT
an
，所构建的多元方程如下：X1+X2+
…
X
n
+Y＝N；(X1*MU
a1
)/(X1*MU
a1
+X1*WT
a1
+X2*MU
a2
+X2*WT
a2
+
…
X
n

【专利技术属性】
技术研发人员：张华，徐安然，秦资，
申请(专利权)人：上海思路迪生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：