携带并表达IL-27的肿瘤特异性T淋巴细胞的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种携带并表达IL

【技术实现步骤摘要】
携带并表达IL
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27的肿瘤特异性T淋巴细胞的制备方法


[0001]本专利技术涉及肿瘤免疫治疗
，具体地说，是关于一种携带并表达IL
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27的肿瘤特异性T淋巴细胞的制备方法。

技术介绍

[0002]肿瘤对人类的生命健康造成十分严重的危害，近二十年来，国内外肿瘤免疫治疗研究取得了重大进展，其中以T淋巴细胞为基础的过继转输治疗已经成为目前临床效果显著的一类新型抗肿瘤免疫治疗方法。它的基本原理是指将自体肿瘤浸润T淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)在体外刺激扩增，或把自体外周血淋巴细胞经基因工程改造后，使其具有肿瘤抗原特异性，再进一步经体外扩增后制成的细胞制剂回输机体，来达到治疗肿瘤的目的。
[0003]然而，T细胞过继免疫治疗实体肿瘤仍有一系列问题有待克服。首先，从肿瘤浸润淋巴细胞中扩增特异性T淋巴细胞的过程冗长，需要的数量巨大。经过长时间体外培养的T淋巴细胞难以在肿瘤微环境中存活并发挥作用。其次，肿瘤诱导扩增的抑制性细胞，如调节性T细胞(Treg)常常限制过继转输的效应T细胞的功能。去除Treg细胞的免疫治疗(如抗CTLA
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4抗体治疗)也常常引起严重自身免疫性疾病，导致治疗无法继续或失败。因此，提升过继转输的肿瘤特异性T淋巴细胞的存活能力，抑制Treg细胞亚群是提升T细胞过继免疫治疗的关键。
[0004]T细胞过继治疗实体肿瘤取得了很大的成功，但目前对晚期肿瘤的治疗还远未达到满意的效果，其原因在于：肿瘤内部是一个缺氧的微环境，T细胞难以在肿瘤微环境中长期存活并保持杀伤活性；肿瘤微环境呈现免疫抑制的特点，肿瘤诱导的抑制性细胞(如Treg)的扩增可限制肿瘤特异性T细胞发挥抗肿瘤作用；此外，在长期与肿瘤细胞的搏斗过程中，肿瘤特异性T细胞往往呈现功能衰竭(Zhou P，et al：B7 blockade alters the balance between regulatory T cells and tumor
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reactive T cells for immunotherapy of cancer.Clinical cancer research：an official journal of the American Association for Cancer Research 2009，15(3)：960
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970)。
[0005]IL
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27是IL
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12细胞因子家族的一员，由一个EBV诱导基因3(EBI3)和P28两个亚单位构成，一般由活化的抗原提呈细胞(APCs)如树突状细胞和巨噬细胞等分泌。IL
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27信号通过细胞上异源二聚体受体IL
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27R传导至胞内。IL
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27R由WSX
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1和gp130亚基构成。WSX
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1和gp130可以在包括T细胞、NK细胞、B细胞、髓系细胞等多种细胞上表达。IL
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27、IL
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27R的信号通过增强多种Jak家族信号和激活传导因子STAT1和STAT3从而发挥生物学活性。IL
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27不仅能够直接抑制肿瘤的生长、增殖、转移，而且能够通过免疫调控增强其抗肿瘤作用。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的就在于提供一种新的T细胞治疗肿瘤的方案，以解决目前T细胞过继治疗实体肿瘤中所遇到的肿瘤特异性T细胞在肿瘤微环境中的存活能力较差，以及肿瘤诱
导的抑制性细胞(如Treg)的扩增可限制肿瘤特异性T细胞发挥抗肿瘤作用的问题。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用以下解决方案：
[0008]本专利技术的第一个方面，提供了一种携带并表达IL
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27的肿瘤特异性T淋巴细胞的制备方法，包括以下步骤：
[0009]S1：PCR扩增表达IL
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27的基因，插入载体质粒中，获得表达IL
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27的重组表达质粒；
[0010]S2：将S1获得的重组表达质粒与包装质粒混合后转染包装病毒，得到携带并表达IL
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27的逆转录病毒；
[0011]S3：将S2得到的逆转录病毒感染分离获得的T淋巴细胞，得到携带并表达IL
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27的肿瘤特异性T淋巴细胞。
[0012]根据本专利技术的优选实施例，步骤S1中所述的载体质粒为pMigR1。
[0013]根据本专利技术的优选实施例，步骤S2中所述的包装质粒为pCL
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Eco。
[0014]根据本专利技术的优选实施例，步骤S2中所述的转染包装病毒是将转染试剂与重组表达质粒和包装质粒的混合质粒按1∶3的比例混合，然后转染入人胚胎肾细胞HEK
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293T中。
[0015]本专利技术的第二个方面，提供了按照上述方法制备得到的携带并表达IL
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27的肿瘤特异性T淋巴细胞。
[0016]本专利技术的第三个方面，提供了一种携带并表达IL
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27的逆转录病毒的构建方法，包括以下步骤：
[0017]S1：PCR扩增表达IL
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27的基因，插入载体质粒中，获得表达IL
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27的重组表达质粒；
[0018]S2：将S1获得的重组表达质粒与包装质粒混合后转染包装病毒，得到携带并表达IL
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27的逆转录病毒。
[0019]根据本专利技术的优选实施例，步骤S1中所述的载体质粒为pMigR1。
[0020]根据本专利技术的优选实施例，步骤S2中所述的包装质粒为pCL
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Eco。
[0021]根据本专利技术的优选实施例，步骤S2中所述的转染包装病毒是将转染试剂与重组表达质粒和包装质粒的混合质粒按1∶3的比例混合，然后转染入人胚胎肾细胞HEK
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293T中。
[0022]本专利技术的第四个方面，提供了按照上述方法构建得到的携带并表达IL
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27的逆转录病毒。
[0023]本专利技术具有以下有益效果：
[0024]1、本专利技术通过构建携带并表达IL
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27的逆转录病毒，并进一步感染分离获得的T淋巴细胞，得到携带并表达IL
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27的肿瘤特异性T淋巴细胞，证实了靶向肿瘤的转基因T淋巴细胞递送IL
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27到肿瘤并促进肿瘤免疫治疗的可行性。
[0025]2、本专利技术的方法制备得到的携带并表达IL
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27的肿瘤特异性T淋巴细胞用于治疗肿瘤，与单独的肿瘤特异性T淋巴细胞相比，能够显著抑制小鼠的肿瘤生长，延长荷瘤小鼠的生存期，增强T淋巴细胞的治疗效果，并且还能够改善过继肿瘤特异性T淋巴细胞的存活率并抑制Treg细胞亚群。
[0026]3、避免了使用现有的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种携带并表达IL
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27的肿瘤特异性T淋巴细胞的制备方法，其特征在于包括以下步骤：S1：PCR扩增表达IL
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27的基因，插入载体质粒中，获得表达IL
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27的重组表达质粒；S2：将S1获得的重组表达质粒与包装质粒混合后转染包装病毒，得到携带并表达IL
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27的逆转录病毒；S3：将S2得到的逆转录病毒感染分离获得的T淋巴细胞，得到携带并表达IL
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27的肿瘤特异性T淋巴细胞。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述的载体质粒为pMigR1。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述的包装质粒为pCL
‑
Eco。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述的转染包装病毒是将转染试剂与重组表达质粒和包装质粒的混合质粒按1∶3的比例混合，然后转染入人胚胎肾细胞HEK
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293T中。5.权利要求1
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4中任一项所述的方法制备得到的携带...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁苗，潘秋辉，马纪，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心，
类型：发明
国别省市：