一种表达PCV2、PCV3Cap蛋白的重组伪狂犬病毒载体、构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种表达PCV2、PCV3Cap蛋白的重组伪狂犬病毒载体、构建方法与应用，属于疫苗技术领域。该构建方法包括以下步骤：(1)将SEQ ID NO.1序列插入到pEGFP

【技术实现步骤摘要】
一种表达PCV2、PCV3 Cap蛋白的重组伪狂犬病毒载体、构建方法与应用


[0001]本专利技术属于疫苗
，尤其涉及一种表达PCV2、PCV3 Cap蛋白的重组伪狂犬病毒载体、构建方法与应用。

技术介绍

[0002]猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是环状单链DNA病毒，无囊膜，属于圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)。PCV2自1998年被发现后，一直是一种全球传播的频发病原，感染的猪只会出现多系统衰竭症、肠炎、肺炎和生殖障碍等症状，这些疾病被统称为猪圆环病毒病(PCVD)或猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)。2016年，PALINSKI在患有猪皮炎肾病综合征(PDNS)、生殖衰竭、心肌炎和多系统炎症的母猪的流产胎儿中检测到了一种新型圆环病毒，命名为PCV3，其与PCV2仅有37％的同源性。随着进一步的研究发现，PCV3在患病或部分健康猪只中均可检测出，主要导致猪只生殖障碍、皮肤疾病以及多系统炎症。许多研究报道指出，猪单独感染PCV单一亚型时不会产生严重的PCVD症状，而PCV2与PCV3之间的共感染会加重临床症状的表现。因此，同时免疫PCV2和PCV3的联合疫苗的研发，对生产上有重要意义。
[0003]细胞因子在免疫反应中发挥着重要作用，基于他们功能的不同，细胞因子可以分为炎性因子，Th1和Th2型细胞因子。其中，IL
‑
4是由Th2细胞分泌的细胞因子，它主要在体液免疫中发挥重要作用,如影响免疫球蛋白的产生、类型转变和分泌。除此之外，IL
‑
4在调节淋巴细胞，巨噬细胞，成纤维细胞等细胞的增殖、凋亡方面也发挥着不可替代的作用。因此将其作为疫苗的分子佐剂，可以有效增强免疫反应，加强疫苗效果。
[0004]PCV2、PCV3和PRV是危害全球养猪业的重要传染病，在我国很多猪场流行，给我国养猪业带来了巨大的经济损失。PCV2和PCV3作为近年来常见的混合感染病毒，到目前为止尚无联合疫苗用来防控。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的之一在于提供一种表达PCV2、PCV3 Cap蛋白的重组伪狂犬病毒载体的构建方法，所述方法包括以下步骤：
[0006](1)将SEQ ID NO.1序列插入到含有伪狂犬gI和28K基因序列同源臂的pEGFP
‑
gI28k真核表达质粒中，获得pEGFP
‑
gI28k
‑
2Cap
‑
3Cap
‑
IL4载体；
[0007](2)pEGFP
‑
gI28k
‑
2Cap
‑
3Cap
‑
IL4质粒和psgRNA
‑
gE质粒转染BHK
‑
21细胞，再接种PRV
‑
XJ
‑
ΔTK病毒液；
[0008](3)待细胞出现80％的病变并观察到发出绿色荧光的病毒蚀斑时，将细胞反复冻融，离心取上清，上清液中含有表达PCV2Cap、PCV3Cap和IL
‑
4且缺失gE、gI、TK的PRV真核表达载体rPRVXJ
‑
ΔgE/gI/TK
‑
2Cap
‑
3Cap
‑
IL4。
[0009]进一步地，所述步骤(1)中SEQ ID NO.1序列插入了pEGFP
‑
gI28k真核表达质粒
XhoI和BclI酶切识别位点之间。
[0010]更进一步地，所述步骤(2)中pEGFP
‑
gI28k
‑
2Cap
‑
3Cap
‑
IL4质粒和psgRNA
‑
gE质粒转染BHK
‑
21细胞24h后，再接种PRV
‑
XJ
‑
ΔTK病毒液。
[0011]更进一步地，还包括步骤(4)rPRVXJ
‑
ΔgE/gI/TK
‑
2Cap
‑
3Cap
‑
IL4的纯化。
[0012]更进一步地，所述步骤(4)rPRVXJ
‑
ΔgE/gI/TK
‑
2Cap
‑
3Cap
‑
IL4的纯化采用了96孔板有限稀释法和6孔板病毒噬斑纯化方法。
[0013]本专利技术的目的之二在于提供上述构建方法构建得到的重组伪狂犬病毒载体rPRVXJ
‑
ΔgE/gI/TK
‑
2Cap
‑
3Cap
‑
IL4。
[0014]本专利技术的目的之三在于提供上述重组伪狂犬病毒载体rPRVXJ
‑
ΔgE/gI/TK
‑
2Cap
‑
3Cap
‑
IL4在制备猪圆环病毒疫苗中的应用。
[0015]进一步地，所述猪圆环病毒为PCV2和PCV3。
[0016]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0017]本专利技术以PRV分离株XJ株为亲本毒株，利用同源重组技术和Crisprcas基因编辑技术构建共表达PCV2Cap蛋白、PCV3Cap蛋白和IL
‑
4蛋白的重组伪狂犬病毒，在小鼠模型中对该重组病毒疫苗的体液免疫和细胞免疫效应进行评价。其不仅达到一针多免的效果，还使用分子佐剂增强疫苗的免疫原性，形成PCV2和PCV3重组伪狂犬病毒减毒活疫苗的初步探索，为研究开发出有效的联合疫苗提供思路。
附图说明
[0018]图1为实施例1中质粒CRISPR/Cas
‑
gE和pEGFP
‑
gI28K
‑
2Cap
‑
3Cap
‑
IL4共转染24h后表达带有EGFP绿色荧光的蛋白图。
[0019]图2为实施例1中rPRVXJ
‑△
gE/gI/TK
‑
2Cap
‑
3Cap
‑
IL4病毒噬斑图。
[0020]图3为实施例1中rPRVXJ
‑△
gE/gI/TK
‑
2Cap
‑
3Cap
‑
IL4F21蛋白样品中外源蛋白PCV2Cap、PCV3 Cap、IL
‑
4的表达情况，其中A：PCV2 Cap；B：PCV3 Cap；C：IL
‑
4。
具体实施方式
[0021]实施例1
[0022]1.转移质粒的设计和合成
[0023]根据PCV2 Cap、PCV3 Cap和IL
‑
4蛋白序列，人工设计能够表达PCV2Cap、PCV3Cap和I本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表达PCV2、PCV3Cap蛋白的重组伪狂犬病毒载体的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)将SEQ ID NO.1序列插入到含有伪狂犬gI和28K基因序列同源臂的pEGFP
‑
gI28k真核表达质粒中，获得pEGFP
‑
gI28k
‑
2Cap
‑
3Cap
‑
IL4质粒；(2)pEGFP
‑
gI28k
‑
2Cap
‑
3Cap
‑
IL4质粒和psgRNA
‑
gE质粒转染BHK
‑
21细胞，再接种PRV
‑
XJ
‑
ΔTK病毒液；(3)待细胞出现80％的病变并观察到发出绿色荧光的病毒蚀斑时，将细胞反复冻融，离心取上清，上清液中含有表达PCV2Cap、PCV3Cap和IL
‑
4且缺失gE、gI、TK的PRV真核表达载体rPRVXJ
‑
ΔgE/gI/TK
‑
2Cap
‑
3Cap
‑
IL4。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中SEQ ID NO.1序列插入了pEGFP
‑
gI28k真核表达质粒XhoI和BclI酶切识别位点之间。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中pEGFP
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【专利技术属性】
技术研发人员：朱玲，杨雁婷，徐志文，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：