本发明专利技术涉及一种黄曲霉毒素B1纳米抗体、自组装多价融合纳米抗体及制备方法。本发明专利技术提供了黄曲霉毒素B1纳米抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。同时提供了自组装多价黄曲霉毒素B1融合纳米抗体，其由黄曲霉毒素B1纳米抗体、荧光蛋白和六个组氨酸标签H6融合在一起得到。本发明专利技术提供了一种特异性较高、灵敏度高的黄曲霉毒素B1纳米抗体，并通过自组装多价融合纳米抗体的构建进一步提高了纳米抗体的亲和力、灵敏度，同时可发出荧光，在建立荧光检测方法中无需引入外源荧光探针，简化制备步骤，降低成本，为建立更高效、灵敏、低廉的免疫快速检测方法提供可能。测方法提供可能。测方法提供可能。
【技术实现步骤摘要】
一种黄曲霉毒素B1纳米抗体、自组装多价融合纳米抗体及制备方法
[0001]本专利技术涉及纳米抗体，具体涉及一种黄曲霉毒素B1纳米抗体及自组装的融合纳米抗体，属于基因工程和免疫快速检测
技术介绍
[0002]在自然界中黄曲霉毒素(Aflatoxin)分布广泛，易污染花生、玉米、大米等农作物，一旦进入食物链，对人体致畸、致癌、致突变，严重威胁人民生命健康。如果其污染含量超过限量标准，将造成巨大经济损失。因此创建快速、灵敏的黄曲霉毒素检测技术，及时发现黄曲霉毒素污染，避免危害，对保障农产品质量安全和人民健康具有重大意义。
[0003]纳米抗体(nanobody，Nb)是存在于骆驼、鲨鱼体内的一种单域重链抗体，分子量仅15～17kDa，长和直径约为4nm和2.5nm。纳米抗体具有良好的溶解性、热稳定性和有机溶剂耐受性，其体积小易于通过基因工程进行改造。
[0004]在免疫检测当中，亲和力表示抗原抗体的结合强度，特异性为能够特异性识别抗原的能力，亲和力和特异性影响检测的稳定性和专一性，对检测数据的准确性起着重要的作用。本专利技术研究提供了一种黄曲霉毒素B1纳米抗体，并通过基因工程改造，获得特异性强、亲和力高的自带荧光的多价黄曲霉毒素B1融合纳米抗体，为开发出高效、灵敏、低廉的免疫检测方法提供技术支撑。
技术实现思路
[0005]本专利技术的目的是针对现有技术的不足提供一种黄曲霉毒素B1纳米抗体、及其自组装多价融合纳米抗体及制备方法。
[0006]为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：
[0007]本专利技术第一方面提供一种黄曲霉毒素B1纳米抗体，所述的黄曲霉毒素B1纳米抗体片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0008]本专利技术第二方面提供黄曲霉毒素B1纳米抗体的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0009]本专利技术第三方面提供一种自组装多价黄曲霉毒素B1融合纳米抗体，其由上述黄曲霉毒素B1纳米抗体、荧光蛋白和六个组氨酸标签H6融合在一起得到。进一步地，其为将黄曲霉毒素B1纳米抗体NbAF通过链接肽linker与荧光蛋白的N端进行连接，再将荧光蛋白的C端引入六个组氨酸标签H6，所述Linker的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
[0010]按上述方案，所述的荧光蛋白为具有绿色荧光的EGFP荧光蛋白，所述EGFP的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；编码核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
[0011]所述自组装多价黄曲霉毒素B1融合纳米抗体NbAF
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EGFP
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H6的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
[0012]本专利技术第四方面提供上述自组装多价黄曲霉毒素B1融合纳米抗体的编码基因。其
具体为自组装多价黄曲霉毒素B1融合纳米抗体NbAF
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EGFP
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H6，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
[0013]本专利技术第五方面提供自组装多价黄曲霉毒素B1融合纳米抗体的制备方法，通过无缝克隆法构建表达载体pET
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22b
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VHH
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linker
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荧光蛋白
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H6，将所构建的表达载体在宿主细胞中进行表达，制备自组装多价黄曲霉毒素B1融合纳米抗体。
[0014]按上述方案，所述表达载体pET
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22b
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VHH
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linker
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荧光蛋白
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H6的构建方法包括以下步骤：
[0015](1)利用PCR技术获得含有linker的黄曲霉毒素B1纳米抗体VHH抗体基因，同时在VHH
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linker两端引入同源臂为下一步克隆做准备；
[0016](2)将载体质粒pET
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22b
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荧光蛋白
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H6进行双酶切获得线性化载体，通过无缝克隆的方式将含有同源臂的VHH
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linker和线性化载体进行连接，通过鉴定后获得表达载体pET
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22b
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VHH
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linker
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荧光蛋白
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H6。
[0017]按上述方案，所述的表达方法包括如下步骤：
[0018](1)将表达载体pET
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22b
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VHH
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linker
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荧光蛋白
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H6转化至大肠杆菌表达菌株E.coli BL21(DE3)；
[0019](2)诱导表达融合蛋白，纯化获得自组装多价黄曲霉毒素B1融合纳米抗体
[0020]本专利技术通过基因编码串联的方式，对黄曲霉毒素B1纳米抗体(NbAF)和荧光蛋白(本专利技术一个具体实施例中荧光蛋白选择EGFP)的基因编码通过linker进行串联融合，同时在荧光蛋白的C端引入H6标签，最终表达形成模块化融合蛋白，H6标签是具有阳性离子特性的阳离子肽，同时NbAF具有阳性氨基酸(Arg、His、Lys)15个，超过NbAF总氨基酸的十分之一，NbAF也具备阳离子肽特征。NbAF和H6通过静电力自发低聚成规则的纳米颗粒，通过构像空间调整，经过氢键、范德华力等相互作用，由此通过起始力
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静电力的作用，使模块化融合蛋白自发地组装成多聚体，最后通过氢键、范德华力等使这种多聚体更加稳定。此方法可进一步有效提高由此获得的自组装多价融合纳米抗体的亲和力和灵敏度，同时引入荧光蛋白可发出荧光(如引入增强型绿色荧光蛋白ERGP，可获得具有绿色荧光特性的自组装多价融合纳米抗体)，在建立荧光检测方法中无需引入外源荧光探针，简化制备步骤降低成本，为建立更高效、灵敏、低廉的免疫快速检测方法提供可能。
[0021]本专利技术对比现有技术，具有如下的优点和效果：
[0022]本专利技术提供的黄曲霉毒素B1纳米抗体特异性较高，灵敏度高；
[0023]与单价纳米抗体相比，本专利技术的自组装多价黄曲霉毒素B1融合纳米抗体亲和力和灵敏度有进一步的显著提高。同时将荧光蛋白与黄曲霉毒素B1纳米抗体进行重组表达，获得荧光特性的自组装多价融合纳米抗体无需引入其他荧光探针即可作为标记探针用于胞内定位或者检测。与单克隆抗体相比，生产成本低廉，各批次间稳定性高。且具有更高的稳定性和亲和力，更具有大规模生产和应用的潜能。
附图说明
[0024]图1是重组蛋白NbAF
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EGFP
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H6表达及纯化结果图，泳道M：蛋白Marker；泳道1：周质总蛋白；泳道2：流穿液；泳道3:20mmol/L咪唑洗脱物；泳道4:40mmol/L咪唑洗脱物；泳道5:300mmol/L咪唑洗脱物；
[0025]图2是纯化自组装纳米抗体场发射本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种黄曲霉毒素B1纳米抗体，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素B1纳米抗体的编码基因，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。3.一种自组装多价黄曲霉毒素B1融合纳米抗体，其特征在于：由权利要求1所述的黄曲霉毒素B1纳米抗体、荧光蛋白和六个组氨酸标签H6融合在一起得到。4.根据权利要求3所述的自组装多价黄曲霉毒素B1融合纳米抗体，其特征在于：将权利要求1所述的黄曲霉毒素B1纳米抗体通过链接肽linker与荧光蛋白的N端进行连接，再将荧光蛋白的C端引入六个组氨酸标签H6，所述Linker的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。5.根据权利要求3或4所述的自组装多价黄曲霉毒素B1融合纳米抗体，其特征在于：所述的荧光蛋白为具有绿色荧光的EGFP荧光蛋白，所述EGFP的氨基酸序列如SEQ IDNO:4所示；所述自组装多价黄曲霉毒素B1融合纳米抗体为NbAF
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EGFP
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H6，氨基酸序列如SEQ IDNO：3所示。6.权利要求5所述的自组装多价黄曲霉毒素B1融合纳米抗体的编码基因，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。7.权利要求3所述的自组装多价黄曲霉毒素B1融合纳米抗体的制备方法，其特征在于：通过无缝克隆法构建表达载体pET
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22b
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VHH
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linker
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荧光蛋白
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H6，将所构建的表达...
【专利技术属性】
技术研发人员：唐晓倩，李培武，李志强，张奇，张文，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：
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