一种大黄鱼抗恶臭假单胞菌病良种选育方法技术

本发明专利技术公开一种大黄鱼抗恶臭假单胞菌病良种选育方法，包括步骤一、构建参考群体，步骤二、构建候选群体，步骤三、参考群体和候选群体的基因分型，步骤四、构建遗传分析模型，步骤五、通过计算候选群体个体多性状复合估计育种值进行优良亲本筛选；本发明专利技术在准确评定抗病表型的基础上，充分利用个体基因型信息，大幅提高遗传改良效果，快速准确培育出抗病能力显著提高的大黄鱼优良种质，有效缩短育种周期，为培育抗恶臭假单胞菌病的优质大黄鱼新品种提供了高效可靠的新方法。供了高效可靠的新方法。供了高效可靠的新方法。

【技术实现步骤摘要】
一种大黄鱼抗恶臭假单胞菌病良种选育方法


[0001]本专利技术涉及水产生物育种
，尤其涉及一种大黄鱼抗恶臭假单胞菌病良种选育方法。

技术介绍

[0002]大黄鱼作为我国东南沿海地区最重要的渔业资源，目前已形成年产量超过20万吨的养殖规模，位列我国海水鱼类养殖产业之首，形成一条从养殖装备、饲料动保、苗种销售、养殖和产品加工的产业链，造就一批国家级、省级产业化龙头企业，为经济发展、人员就业做出了重要贡献；但是大黄鱼养殖产业粗放式快速发展的同时也积累了大量制约产业健康发展的瓶颈问题，尤为突出的即为病害频发问题，其中恶臭假单胞菌引起的内脏白点病是限制大黄鱼健康养殖、快速发展的重要病害之一。
[0003]而恶臭假单胞菌发病为体内发病，发病初期难以发现症状，发病后期病鱼的肝脏、脾脏、肾脏上已布满白色细菌结节，药物治疗效果不理想，且药物治疗使用抗菌素类药物等防病措施虽然有一定效果，但无法从根本上解决水产养殖业中的病害问题，同时抗菌素类药物具有容易在鱼体内积累，对消费者的健康具有潜在危害，容易使病原菌产生抗药性以及严重污染养殖环境等问题，因此，本专利技术提出一种大黄鱼抗恶臭假单胞菌病良种选育方法以解决现有技术中存在的问题。

技术实现思路

[0004]针对上述问题，本专利技术的目的在于提出一种大黄鱼抗恶臭假单胞菌病良种选育方法，该大黄鱼抗恶臭假单胞菌病良种选育方法在准确评定抗病表型的基础上，充分利用个体基因型信息，大幅提高遗传改良效果，快速准确培育出抗病能力显著提高的大黄鱼优良种质，有效缩短育种周期。r/>[0005]为实现本专利技术的目的，本专利技术通过以下技术方案实现：一种大黄鱼抗恶臭假单胞菌病良种选育方法，包括以下步骤：
[0006]步骤一、构建参考群体，以8月龄大黄鱼作为参考群体，通过预实验确定病原菌恶臭假单胞菌感染后108h的半致死量，对参考群体进行感染测定抗病表型，并采集每尾个体鳍条组织样品，通过个体基因分型，得到所有个体的基因型数据；
[0007]步骤二、构建候选群体，选取2年龄以上个体作为优良亲本的候选群体，通过PIT标记每一尾个体并采集鳍条组织，通过个体基因分型，得到基因型数据；
[0008]步骤三、基因分型，提取参考群体和候选群体鳍条样品DNA，利用55K的大黄鱼液相SNP芯片对参考群体和候选群体的基因型数据进行分型，并对分型结果进行进一步筛选，获得高质量的基因型数据；
[0009]步骤四、构建遗传分析模型，根据对影响因子显著性检验筛选出存在显著差异的影响因子构建遗传分析模型，利用GBLUP方法进行遗传评估，预测候选群体个体的基因组估计育种值(GEBV)；
[0010]步骤五、优良亲本筛选，计算候选群体个体多性状复合的基因组估计育种值，并按照30％的留种率筛选出育种性能优良的大黄鱼个体，对优良亲本进行强化培育并进行繁殖，得到优良抗病苗种。
[0011]进一步改进在于：所述步骤一中预实验具体为以360尾8月龄大黄鱼为研究材料，分为6组，每个实验组60条鱼设置3个平行，每个平行20尾。不同浓度(0、1
×
103、1
×
104、1
×
105、1
×
106和1
×
107cfu/mL)病原菌感染后，连续观察7天，记录每条鱼死亡时间，并解剖确定病理特征，统计分析得出致病菌菌株对大黄鱼108h的半致死浓度为1
×
10
4.73
cfu/mL。
[0012]进一步改进在于：所述步骤一中对参考群体进行感染测定抗病表型具体为以1500尾8月龄大黄鱼作为参考群体，使用养殖桶暂养一周，随后使用半致死量病原菌对参考群体进行感染，然后正常饲养，统计个体性别、死亡时间、测定死亡个体肝脏和脾脏组织单位带菌量，测量死亡个体生长指标(全长、体长和体重)，实验持续到所有个体全部死亡；实验以个体死亡时间、感染108h后个体存活状态、肝脏和脾脏组织单位带菌量作为个体抗病力的表型指标，从而获得参考群体抗病表型信息。
[0013]进一步改进在于：所述测定死亡个体肝脏和脾脏组织单位带菌量时，先提取肝脏和脾脏组织总DNA，经琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop检测合格后，将样本DNA浓度调整为50ng/μl，再利用恶臭假单胞菌特异性引物进行荧光定量PCR检测，同时使用大黄鱼单拷贝基因作为内参基因，用2
‑
ΔΔCt
法计算得到恶臭假单胞菌在单位细胞中的相对丰度。
[0014]进一步改进在于：所述病原菌获取方法为先从大黄鱼患内脏白点的病鱼脾和肝脏中分离、纯化、鉴定到恶臭假单胞菌，随后使用平板划线法将纯化的恶臭假单胞菌菌液接种于TSA平板，在28℃恒温培养12～24h，挑取单克隆菌落于灭菌后TSB培养基中置于28℃恒温摇床12～15h，测量菌液OD值，稀释菌液，并使用平板计数法测量菌液浓度均为1
×
105cfu/mL，即得到病原菌。
[0015]进一步改进在于：所述步骤一和步骤二中采集获取鳍条组织后置于无水乙醇中保存，用于提取基因组DNA，并利用SNP芯片进行基因分型，所述候选群体规模控制在1000尾以上。
[0016]进一步改进在于：所述步骤四中显著差异的影响因子包括性别和实验桶，遗传分析模型由下式表示：
[0017]Y＝Xb+Zu+e
[0018]其中Y表示抗病表型性状，b为固定效应，u表示个体随机效应，e为剩余残差，X表示固定效应关联矩阵，Z表示随机效应关联矩阵。
[0019]进一步改进在于：所述步骤五中按照抗病性状赋权重0.8，生长性状赋权重0.2的标准，并按照公式：
[0020]Y＝0.8
×
(0.4
×
存活时间+0.4
×
存活状态+0.1
×
肝脏带菌量+0.1
×
脾脏带菌量)+0.2
×
(0.4
×
全长+0.4
×
体长+0.2
×
体重)
[0021]以计算候选群体个体多性状复合的基因组估计育种值(GEBV)。
[0022]本专利技术的有益效果为：本专利技术在准确评定抗病表型的基础上，充分利用个体基因型信息，大幅提高遗传改良效果，快速准确培育出抗病能力显著提高的大黄鱼优良种质，有效缩短育种周期，为培育抗恶臭假单胞菌病的优质大黄鱼新品种提供了高效可靠的新方法。
附图说明
[0023]图1为本专利技术实施例1方法流程图。
[0024]图2为本专利技术实施例2选育系与未选育系人工感染后不同时间段的累积死亡率比较曲线图。
具体实施方式
[0025]为了加深对本专利技术的理解，下面将结合实施例对本专利技术做进一步详述，本实施例仅用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术保护范围的限定。
[0026]实施例1
[0027]根据图1所示，本实施例提供了一种大黄鱼抗恶臭假单胞菌病良种选育方法，包括以下步骤：
[本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大黄鱼抗恶臭假单胞菌病良种选育方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、构建参考群体，以8月龄大黄鱼作为参考群体，通过预实验确定病原菌恶臭假单胞菌感染后108h的半致死量，对参考群体进行感染测定抗病表型，并采集每尾个体鳍条组织样品，通过个体基因分型，得到所有个体的基因型数据；步骤二、构建候选群体，选取2年龄以上个体作为优良亲本的候选群体，通过PIT标记每一尾个体并采集鳍条组织，通过个体基因分型，得到基因型数据；步骤三、基因分型，提取参考群体和候选群体鳍条样品DNA，利用55K的大黄鱼液相SNP芯片对参考群体和候选群体的基因型数据进行分型，并对分型结果进行进一步筛选，获得高质量的基因型数据；步骤四、构建遗传分析模型，根据对影响因子显著性检验筛选出存在显著差异的影响因子构建遗传分析模型，利用GBLUP方法进行遗传评估，预测候选群体个体的基因组估计育种值；步骤五、优良亲本筛选，计算候选群体个体多性状复合的基因组估计育种值，并按照30％的留种率筛选出育种性能优良的大黄鱼个体，对优良亲本进行强化培育并进行繁殖，得到优良抗病苗种。2.根据权利要求1所述的一种大黄鱼抗恶臭假单胞菌病良种选育方法，其特征在于：所述步骤一中预实验具体为以360尾8月龄大黄鱼为研究材料，分为6组，每个实验组60条鱼设置3个平行，每个平行20尾，利用0、1
×
103cfu/mL、1
×
104cfu/mL、1
×
105cfu/mL、1
×
106cfu/mL和1
×
107cfu/mL六种不同浓度病原菌感染后，连续观察7天，记录每条鱼死亡时间，并解剖确定病理特征，统计分析得出致病菌菌株对大黄鱼108h的半致死浓度为1
×
10
4.73
cfu/mL。3.根据权利要求1所述的一种大黄鱼抗恶臭假单胞菌病良种选育方法，其特征在于：所述步骤一中对参考群体进行感染测定抗病表型具体为以1500尾8月龄大黄鱼作为参考群体，使用养殖桶暂养一周，随后使用半致死量病原菌对参考群体进行感染，然后正常饲养，统计个体性别、死亡时间、测定死亡个体肝脏和脾脏组织单位带菌量，测量死亡个体全长、体长和体重的生长指标，实验持续到所有个体全部死亡；实验以个体死亡时间、感染108h后个体存活状态、肝脏和脾脏组织单位带菌量作为个...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘峰，叶挺，韩明明，魏福亮，楼宝，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：