【技术实现步骤摘要】
NK细胞的细胞外囊泡的制备及应用
[0001]本专利技术涉及生物医药
,尤其涉及NK细胞的细胞外囊泡的制备及应用。
技术介绍
[0002]自然杀伤细胞(natural killer cells,简称 NK 细胞)是先天淋巴样细胞的一个亚群,是对抗肿瘤的第一道防线。NK细胞具有直接和间接靶向抑制肿瘤细胞的能力,而肿瘤源性分子、肿瘤基质细胞和肿瘤细胞可以抑制这种过程,最终促进肿瘤的进展和多步转移过程。基于NK细胞在肿瘤生物学中的关键作用,很多科研人员把它作为治疗肿瘤疾病的一个前瞻性靶点。同时,NK细胞分泌的细胞外囊泡(EV)具有肿瘤归巢能力,且其含有部分NK细胞的活性物质,可以发挥抗肿瘤的功能。
[0003]EV是细胞间通讯的关键介质,在免疫反应的调节中发挥着至关重要的作用。EV包括外泌体、微泡和凋亡小体,携带蛋白质、碳水化合物、脂质等生物活性分子和遗传信息,包括miRNA。其作为生理和病理过程的关键中介,因其体积小、免疫原性低、操作相对易用性和稳定性而在癌症治疗中具有重大临床潜力。外泌体是细胞分泌到细胞外的成分,目前主要用于疾病诊断。由于外泌体的产量比较低,至今还无法大量制备,严重制约着其作为药品的产业化。
技术实现思路
[0004]本专利技术的目的是解决现有技术中的问题,提供人脐带血NK细胞分泌的细胞外囊泡的制备及应用。
[0005]本专利技术的技术方案是:NK细胞的细胞外囊泡在制备治疗肿瘤的产品中的应用,所述NK细胞的细胞外囊泡为人脐带血NK细胞分泌的细胞外囊泡,所述肿瘤为乳腺 ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.NK细胞的细胞外囊泡在制备治疗乳腺癌的产品中的应用,其特征在于:所述NK细胞的细胞外囊泡为人脐带血NK细胞分泌的细胞外囊泡,所述的NK细胞的细胞外囊泡的制备方法为:步骤1:分血;运用密度梯度离心法,分离脐带血单个核细胞;步骤2:补液;通过增加NK细胞培养体积,扩大培养规模;步骤3:装袋;NK细胞从培养瓶装入培养袋进一步扩增培养;步骤4:将培养有细胞的培养袋与一装有新鲜培养基的培养袋混合,然后分为两袋进行进一步扩增培养;步骤5:收集NK细胞的培养上清;步骤6:制备浓缩的细胞外囊泡;将经过多次扩增培养细胞过程的培养基取出,制备浓缩的细胞外囊泡。2.根据权利要求1所述的NK细胞的细胞外囊泡在制备治疗乳腺癌的产品中的应用,其特征在于:所述产品为食品或药品。3.根据权利要求1所述的NK细胞的细胞外囊泡在制备治疗乳腺癌的产品中的应用,其特征在于,所述NK细胞的细胞外囊泡的制备方法中步骤1中分离脐带血单个核细胞的具体操作为:(1)用10 ml移液管将脐带血注入50 ml 离心管中,室温 2000 rpm 离心10分钟;(2) 在此期间准备2支盛有15 ml Ficoll的离心管和1支用于盛装血浆的离心管,并将管盖拧松;(3) 用10 ml移液管将上层血浆转入新的50 ml离心管中,不须完全吸尽血浆,因界面层含有较多白细胞,过度吸取血浆,可能造成白细胞丢失;(4) 用生理盐水1:1稀释血细胞沉(生理盐水:全血体积=1:1),用移液管吹打混匀;(5) 将血细胞悬液缓慢加载到Ficoll层上,要求使分层保持清晰,每管40 ml,室温1600 rpm离心20分钟;(6) 检查离心后情况,共有四层,最上一层为盐水、血浆;其下一层为交界层细胞,包括淋巴细胞和单核细胞;第三层为 Ficoll;最下一层是沉淀的红细胞和粒细胞;(7) 用10 ml 移液管先吸弃最上层大部分液体,吸取第二层交界细胞层,转移到50 ml离心管中,每两管Ficoll分离到的细胞并至一管,但每管细胞悬液不得超过20 ml,用生理盐水补充至45 ml,颠倒混匀,室温2000 rpm离心10分钟;(8) 倾去上清,用10 ml生理盐水悬浮细胞沉淀,补生理盐水至 45 ml,颠倒混匀后,取其中500μl 细胞悬液于1.5 ml EP管中计数,室温2000 rpm离心10分钟;(9) 弃上清并用50 ml的RPMI
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1640培养基重悬单个核细胞,按照1
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1.5
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106的密度平铺T225 培养瓶中;(10) 加1ml滋养层细胞;(11) 在显微镜下观察细胞的形态,然后将内有细胞悬液的培养瓶放入CO2培养箱培养。4.根据权利要求1所述的NK细胞的细胞外囊泡在制备治疗乳腺癌的产品中的应用,其特征在于:所述NK细胞的细胞外囊泡的制备方法中步骤2中通过增加NK细胞培...
【专利技术属性】
技术研发人员:郭红,张秀君,陈佃雷,
申请(专利权)人:山东德升细胞治疗工程技术有限公司,
类型:发明
国别省市:
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