一种促进NK细胞体外扩增的培养基及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种促进NK细胞体外扩增的培养基及其应用，所述培养基由基础培养液、IL

【技术实现步骤摘要】
一种促进NK细胞体外扩增的培养基及其应用


[0001]本专利技术属于细胞培养
，具体涉及一种促进NK细胞体外扩增的培养基及其应用。

技术介绍

[0002]自然杀伤细胞(natural killer cell，NK细胞)是一种无需预先致敏就能非特异性杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的淋巴细胞，是机体免疫系统的重要组成部分。自然杀伤细胞作为机体固有免疫系统中的重要组成部分，是机体抵抗肿瘤、病毒感染的第一道防线，虽然NK细胞在临床应用上的安全性和疗效受到了肯定，但它仅占外周血淋巴细胞的10
‑
20％，因而如何获得高纯度、高质量的NK细胞成为治疗的关键。
[0003]CN114381427A公开了一种NK细胞的体外扩增的方法及其在体外ADCC实验中的应用，所述方法包括以下步骤：构建滋养层细胞；使用滋养层细胞扩增NK细胞。其公开了一种成本低廉、操作简便、高效稳定的NK细胞体外扩增方法，利用扩增后的NK细胞进行抗体ADCC的药效评价，减少了因NK细胞来源不足对NK相关的药物研发的限制。该方法中需要用到滋养层细胞，滋养层细胞法(Feeder cells，如K562、PBMC、U977、CEM等)最显著的优点是扩增倍数及纯度都很高，但是需要构建稳定过表达某些基因的滋养层细胞，这进一步增加了扩增NK细胞的步骤。
[0004]CN105886470A公开了一种扩增NK细胞的方法，所述方法使用失活的LCL饲养细胞、外周血单个核细胞、细胞因子IL
‑
2和IL
‑
15在细胞培养液中进行细胞培养，对外周血单个核细胞中的NK细胞选择性的扩增，其中外周血单个核细胞与失活的LCL饲养细胞的配比为0.5
‑
2.5，细胞因子IL
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2的浓度为100
‑
500U/L，细胞因子IL
‑
15的浓度为5
‑
50ng/mL。所述方法提高了NK细胞的扩增效率，而且提高了NK杀伤功能。但是该方法在培养过程中需要饲养层细胞共同培养，操作复杂、细胞得率低。
[0005]现有的扩增NK细胞的方法证明IL
‑
2、IL
‑
15对NK细胞扩增非常重要，同时加入NK扩增滋养细胞(以慢性髓系白血病细胞系K562为主)能促进NK细胞扩增，然而NK扩增滋养细胞涉及到安全性问题，影响扩增后的NK细胞的临床治疗应用。目前的NK细胞在体外不能得到很好的扩增，因此，开发一种促进NK细胞体外扩增的方法具有重要意义。通过何种办法能有效地在体外获得安全性好、数量足够且纯度较高的NK细胞，这仍然是NK细胞临床治疗需要解决的问题。

技术实现思路

[0006]针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种促进NK细胞体外扩增的培养基及其应用。本专利技术对培养基进行优化，减少培养基中添加物的种类，优化了培养基中组分的浓度，所得培养基能促进NK细胞体外扩增，获得的NK细胞安全性好、纯度较高、数量足够，节省了生产成本，并提高了NK细胞杀伤活性。
[0007]为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0008]第一方面，本专利技术提供一种促进NK细胞体外扩增的培养基，所述培养基由基础培养液、IL
‑
2、IL
‑
15和SCF组成。
[0009]本专利技术所述培养基能解决NK细胞体外扩增效率低的问题，所述培养基成分简单，用少量的添加物就能达到较高的体外扩增效率，且在培养中不使用滋养细胞，安全性增加，采用所述培养基在体外扩增NK细胞获得的NK细胞安全性好、纯度较高，且杀伤活性更高。
[0010]优选地，所述培养基中除基础培养液外各组分按浓度计包括：1
‑
100ng/mL IL
‑
2、1
‑
100ng/mL IL
‑
15和1
‑
100ng/mL SCF。
[0011]本专利技术中，在基础培养液中加入了IL
‑
2、IL
‑
15和SCF；其中，IL
‑
2的浓度为1
‑
100ng/mL，例如可以是1ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL、100ng/mL等。IL
‑
15的浓度为1
‑
100ng/mL，例如可以是1ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL、100ng/mL等。SCF的浓度为1
‑
100ng/mL，例如可以是1ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL、100ng/mL等。
[0012]IL
‑
15与IL
‑
2具有类似的生物学功能，IL
‑
15与IL
‑
2共用γc受体亚单位，这两种细胞因子均能诱导T细胞、B细胞和自然杀伤细胞(NK cell)的分化以及促进T细胞、B细胞和NK细胞的增殖。目前，IL
‑
15常与IL
‑
2联用进行T细胞或NK细胞体外扩增培养。干细胞因子(stem cell factor，SCF)也被称为c
‑
kit配体(KL)，是细胞生长过程中重要的调节因子，它主要是作为配体通过与c
‑
kit结合而发挥生物学作用且对各种组织细胞具有广泛的生物学活性，在本专利技术中，通过在培养基中增加SCF能进一步增加NK细胞体外扩增效率。
[0013]本专利技术中，IL
‑
2、IL
‑
15和SCF的浓度在1
‑
100ng/mL范围内有利于NK细胞体外扩增，浓度过低时其促进增殖的效果较差，添加的浓度高于100ng/mL就达到饱和状态，无法进一步促进增殖。
[0014]优选地，所述培养基中除基础培养液外各组分按浓度计包括：10
‑
100ng/mL IL
‑
2、10
‑
100ng/mL IL
‑
15和10
‑
100ng/mL SCF。
[0015]优选地，所述基础培养液选自MEMa+10％ FBS、1640+10％ FBS、X
‑
VIVO15、ALyS505NK
‑
EX、ALyS505NK
‑
AC、SCGM或AIM V等促进NK细胞扩增的培养基中任意一种。
[0016]第二方面，本专利技术提供第一方面所述的促进NK细胞体外扩增的培养基在NK细胞培养中的应用。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种促进NK细胞体外扩增的培养基，其特征在于，所述培养基由基础培养液、IL
‑
2、IL
‑
15和SCF组成。2.根据权利要求1所述的促进NK细胞体外扩增的培养基，其特征在于，所述培养基中除基础培养液外各组分按浓度计包括：1
‑
100ng/mL IL
‑
2、1
‑
100ng/mL IL
‑
15和1
‑
100ng/mL SCF。3.根据权利要求2所述的促进NK细胞体外扩增的培养基，其特征在于，所述培养基中除基础培养液外各组分按浓度计包括：10
‑
100ng/mLIL
‑
2、10
‑
100ng/mL IL
‑
15和10
‑
100ng/mL SCF。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的促进NK细胞体外扩增的培养基，其特征在于，所述基础培养液选自MEMa+10％FBS、1640+10％FBS、X
‑
VIVO15、ALyS505NK
‑
EX、ALyS505NK
‑
AC、SCGM或AIM V中任意一种。5.权利要求1
‑
4中任一项所述的促进NK细胞体外扩增的培养基在NK细胞培养中的应用。6.一种促进NK细胞体外扩增的方法，其特征在于，所述方法包括：采用权利要求1
‑
4中任一项所述的促进NK细胞体外扩增的培养基扩增培养NK细胞。7.根据权利要求6所述的促进NK细胞体外扩增的方法，其特征在于，所述培养的条件为：将NK细胞接种到促进NK细胞体外扩增的培养基中，培养12
‑
16天，期间2
‑
3天进行一次半换液；优选地，所述NK细胞在培养基中的初始细胞密度为30
‑
150万细胞/mL；优选地，所述NK细胞为人诱导性多能干细胞来源的NK细胞。8.根据权利要求7所述的促进NK细胞体外扩增的方法，其特征在于，所述人诱导性多能干细胞来源的NK细胞采用如下方法制备得到：(1)采用NK分化的培养基I诱导分化人诱导性多能干细胞，诱导分化12
‑
16天，培养液每天进行一次半换液，诱导分化后得到造血祖细胞；所述NK分化的培养基I由基础培养液、BMP4、hVEGF、CHIR99021、bFGF、IGF
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1、TPO、IL
‑
6、SB431542、Flt
‑
3L、SCF和IL
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3组成；(2)将所得造血祖细胞转移到小鼠骨髓基质细胞上，采用NK分化的培养基II诱导分化，诱导分化14
‑
16天，期间2
‑
3天进行一次半换液，诱导分化后得到NK细胞；所述NK分化的培养基II由基础培养液、Flt
‑
3L、IL
‑
7、IL
‑
15、IL
‑
2、IL
‑
12、IL
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18、IL
‑
21、SCF和IL
‑
3组成。9.根据权利要求8所述的促进NK细胞体外扩增的方法，其特征在于，所述NK分化的培养基I的基础培养液选自SCGM、AIM V、stem pro
‑
34、E6、APEL2中任意一种；所述NK分化的培养基I中除基础培养液外各组分按浓度计包括：1
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20ng/mL BMP4、10
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100ng/mL hVEGF、1
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10μM CHIR9...

【专利技术属性】
技术研发人员：请求不公布姓名，
申请(专利权)人：深圳市济因泰世生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：