一种西尼罗病毒核酸检测引物探针组合物及一体化微流控芯片试剂盒制造技术

本发明专利技术属于生物检测技术领域，具体涉及一种西尼罗病毒核酸检测引物探针组合物及一体化微流控芯片试剂盒。采用本发明专利技术提供的引物探针组合物检测西尼罗病毒，具有较好的灵敏度和准确度，扩增效率高，且操作简便，快速省时。本发明专利技术利用一体化芯片上微流控的方式集成了核酸提取、纯化、扩增和检测，解决病原体快速检测的问题，实现“样本进

【技术实现步骤摘要】
一种西尼罗病毒核酸检测引物探针组合物及一体化微流控芯片试剂盒


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种西尼罗热病毒核酸检测引物探针组合物及一体化微流控芯片试剂盒。

技术介绍

[0002]西尼罗热是一种由西尼罗病毒感染的疾病，通常由蚊子传播。在大约80％的感染中，人们很少或没有症状。大约20％的人会出现发烧、头痛、呕吐或皮疹，不到1％的人会发生脑炎或脑膜炎，伴有相关的颈部僵硬、意识混乱或癫痫发作，恢复可能需要数周至数月。
[0003]西尼罗病毒(WNV)是一种单链RNA病毒。它是黄病毒科的成员，来自黄病毒属，该属还包括寨卡病毒、登革热病毒和黄热病病毒。它的基因组大约有11kb，两侧有5'和3'非编码茎环结构，基因组的编码区编码三个结构蛋白和七个非结构蛋白。结构蛋白(C、prM/M、E)分别为衣壳蛋白、前体细胞膜蛋白和包膜蛋白，位于基因组的5'端，被宿主和病毒蛋白酶切割成成熟蛋白。非结构蛋白包括NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。
[0004]在诊断实验室，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)可以推断人西尼罗病毒感染。通过细胞培养从脑脊液、血清或组织中分离病毒，然后用病毒特异性单克隆抗体进行免疫荧光鉴定，也可以得到明确的病毒感染结果。然而，病毒分离分析都需要长达一周的时间才能完成，而且分离需要样本中的活病毒。
[0005]实时荧光定量PCR技术已被用来建立高灵敏度和特异性的检测方法，用于西尼罗病毒的鉴定。例如，专利CN102776297B公布了一种四种虫媒性传播病原体鉴别检测的试剂盒，特别是涉及一种利用多重实时荧光聚合酶链式反应技术检测登革病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、基孔肯雅病毒的试剂盒。专利CN103773896B公布了一种西尼罗病毒的荧光定量RT
‑
PCR检测试剂、试剂盒及其检测方法。
[0006]对于病毒的核酸检测，现有检测系统或方法通常需要在检测前进行样品处理提取核酸，本申请人基于该问题，经过数年研发，与在先申请CN202110057507.0中公开了一种新型现场化快速核酸检测设备CarryOn P1000Q，该设备为“手持全自动封闭式核酸qPCR分析系统”，可在60分钟内完成新冠病毒的现场自动化核酸检测，能够实现“样品进，结果出”的快速检测。本申请即在该技术的基础上，进一步研发出的，能够更好的配合该设备的试剂类专利技术，即西尼罗病毒检测的一体化微流控芯片试剂盒，该试剂盒在一体化芯片上进行样本的核酸提取、纯化、扩增和检测，实现了快速的POCT检测。
[0007]现有的检测试剂盒及方法较操作时间长，且操作步骤繁琐，因此，亟需提供一种灵敏度高、特异性强、覆盖面广、操作简便、省时且节约成本的西尼罗热病毒核酸检测试剂盒及其使用方法。

技术实现思路

[0008]为了解决现有技术中的上述问题，本申请提供了一种西尼罗热检测的引物探针组
合物及一体化微流控芯片试剂盒。采用本专利技术所述的引物探针组合物及一体化微流控芯片试剂盒检测西尼罗热，集成了核酸提取、纯化、扩增和检测，具有较好的灵敏度和准确度，扩增效率高，且操作简便，快速省时。
[0009]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0010]一方面，本专利技术提供了一种检测西尼罗热的引物探针组合物，所述的引物探针组合物包括检测西尼罗病毒的引物探针组合物和检测内参的引物探针组合物。
[0011]具体地，所述的检测西尼罗病毒的引物探针组合物为WNV引物探针组合物；
[0012]具体地，所述的检测内参的引物探针组合物为IPC引物探针组合物。
[0013]进一步具体地，
[0014](1)所述的WNV引物探针组合物为：
[0015]WNV
‑
F(SEQ ID NO:1)：5'
‑
AACGCCGACATGATTGATCCT
‑
3'；
[0016]WNV
‑
R(SEQ ID NO:2)：5'
‑
ATGCTGATCTTGGCCGTCC
‑
3'；
[0017]WNV
‑
P(SEQ ID NO:3)：5'
‑
CTCTTGCGAAGGACCTCCTGGGTG
‑
3'；
[0018](2)所述的IPC引物探针组合物为：
[0019]F(SEQ ID NO:4)：5'
‑
AGTTGCAGTGTAACCGTCATGTA
‑
3'；
[0020]R(SEQ ID NO:5)：5'
‑
TCGACGAGACTCTGCTGTTAA
‑
3'；
[0021]P(SEQ ID NO:6)：5'
‑
CAGTAATCTGCGTCGCACGTGTGCA
‑
3'。
[0022]具体地，所述的西尼罗热的引物探针组合物用于检测西尼罗病毒的NS2A基因。
[0023]具体地，所述探针的5'端标记有荧光报告基团，所述探针的3'端标记有淬灭基团；所述荧光报告基团为CY3、CY5、CY5.5、FAM、HEX、VIC、JOE或ROX中的一种或多种，所述淬灭基团为荧光淬灭基团。
[0024]进一步具体地，所述的检测内参IPC的探针用CY5标记。
[0025]另一方面，本专利技术提供了上述引物探针组合物在制备检测西尼罗热产品中的应用。
[0026]具体地，所述的产品包括但不限于独立试剂、芯片或试剂盒。
[0027]又一方面，本专利技术提供了一种检测西尼罗热的产品，所述的产品包括上述引物探针组合物。
[0028]具体地，所述的产品包括但不限于独立试剂、芯片或试剂盒。
[0029]具体地，所述的产品还包括纯化试剂、风干RT
‑
qPCR反应试剂和冻干IPC质控品。
[0030]进一步具体地，所述的纯化试剂包括裂解液、洗脱液和磁珠，所述的裂解液包括盐酸胍、醋酸钠和Triton X
‑
100，所述的洗脱液包括Tris
‑
HCl，所述的裂解液和洗脱液的体积比为1:2
‑
2.5，所述的磁珠为干化磁珠。
[0031]进一步具体地，所述的裂解液包括6M盐酸胍、0.4M醋酸钠(pH4.7)和2％Triton X
‑
100，所述的洗脱液包括10mM Tris
‑
HCl(pH8.5)。
[0032]进一步具体地，所述的冻干IPC过程质控品的序列为SEQ ID NO:7。
[0033]进一步具体地，所述的冻干IPC过程质控品是RNA假病毒。
[0034]进一步具体地，所述的冻干IPC过程质控品的冻干体系包括甘露醇、海藻糖、牛血清白蛋白、消泡剂、2
‑
羟丙基
‑
β
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测西尼罗病毒的引物探针组合物，其特征在于：所述的引物探针组合物包括检测西尼罗病毒的引物探针组合物和检测内参的引物探针组合物；所述的检测西尼罗病毒的引物探针组合物为WNV引物探针组合物；所述的检测内参的引物探针组合物为IPC引物探针组合物；所述的WNV引物探针组合物为：WNV
‑
F：SEQ ID NO:1：5'
‑
AACGCCGACATGATTGATCCT
‑
3'；WNV
‑
R：SEQ ID NO:2：5'
‑
ATGCTGATCTTGGCCGTCC
‑
3'；WNV
‑
P：SEQ ID NO:3：5'
‑
CTCTTGCGAAGGACCTCCTGGGTG
‑
3'；所述的IPC引物探针组合物为：F：SEQ ID NO:4：5'
‑
AGTTGCAGTGTAACCGTCATGTA
‑
3'；R：SEQ ID NO:5：5'
‑
TCGACGAGACTCTGCTGTTAA
‑
3'；P：SEQ ID NO:6：5'
‑
CAGTAATCTGCGTCGCACGTGTGCA
‑
3'。2.权利要求1所述的引物探针组合物在制备检测西尼罗病毒产品中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的产品包括独立试剂、芯片或试剂盒。4.一种检测西尼罗热的产品，其特征在于：所述的产品包括权利要求1所述的引物探针组合物。5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于：所述的产品还包括纯化试剂、风干RT
‑
qPCR反应试剂和冻干IPC质控品。6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于：所述的纯化试剂包括裂解液、洗脱液和磁珠，所述的裂解液包括盐酸胍、醋酸钠和Triton X
‑
100，所述的洗脱液包括Tris
‑
HCl，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：康洁，高静，苏海龙，金鑫浩，贾欣月，张瑜，蔡亦梅，范东雨，任鲁风，
申请(专利权)人：北京璘客生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：