利用植物表达系统的苜蓿花叶病毒样颗粒制备方法及其运用技术方案

本发明专利技术涉及以病毒样颗粒(virus

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】利用植物表达系统的苜蓿花叶病毒样颗粒制备方法及其运用


[0001]本专利技术涉及利用植物体生产病毒样颗粒(virus
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like particles，VLPs)的方法及其运用，更具体地，涉及在植物体中利用高效率表达载体(expr ession vector)生产重组苜蓿花叶病毒(Alfalfa mosaic virus，AMV)衣壳(capsid)蛋白的方法及将上述重组AMV衣壳蛋白制备为VLP的方法。
[0002]本申请要求于2021年2月25日提交且申请号为第10
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2021
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0025902号的韩国专利申请的优先权，该申请的全部内容通过引用结合在本申请中。

技术介绍

[0003]病毒样颗粒(Virus like particle，VLP)是指通过病毒结构蛋白的结合以与实际病毒相似的形式组装的颗粒。VLP具有组装时不包含病毒基因，且向生物体内注入时，无法增殖的安全抗原的优点。此外，积极进行基于表现出高免疫原性的特征，向各种病原体应用VLP的疫苗的研究研发。
[0004]与病毒相同地，VLP可根据是否具有包膜(envelope)分为包膜VL P(enveloped VLP)(以下，称为“envelop VLP”)和未包膜VLP(no n
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enveloped VLP)(以下，称为“non
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envelop VLP”)。Envelope VLP通过如下的过程生产：将宿主的细胞膜用作包膜，并在其外部表面将病毒的蛋白质表达为抗原的形式，通过与宿主细胞膜的融合过程，向细胞外侧芽殖(budding)。相比于non
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envelope VLP，Envelope VLP的颗粒大小较大，当在细胞膜表达各种病原体的抗原时，可生产同时表达多个抗原的VLP。代表性的Envelope VLP有流感病毒、逆转录病毒、丙型肝炎病毒VLP等。
[0005]Non
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envelope VLP不需要宿主细胞的细胞膜，由non
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enveloped病毒的衣壳蛋白中的一个或多个蛋白质组成。与Envelope VLP相同地，Non
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envelope VLP可同时表达多个抗原，但是同时表达其他病原体的抗原的灵活性相对低。代表性的non
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envelop VLP有乙型肝炎病毒、人乳头瘤病毒、戊型肝炎病毒、轮状病毒VLP等。
[0006]目前，作为用于生产VLP的表达系统，使用细菌、酵母、昆虫细胞、植物细胞、高等动物(哺乳动物、鸟类等)细胞等的表达系统。细菌表达系统最广泛地用于生产重组蛋白，但不能进行类似哺乳动物的蛋白质翻译后修饰(post
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translational modification，PTM)，因此具有不利于生产VL P的缺点，但是生产成本低廉，因此主要用于只能通过衣壳蛋白的组合生产的non
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envelop VLP。酵母也广泛用于生产VLP，用于研发non
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envelop VLP。使用酵母进行乙型肝炎病毒、人乳头瘤病毒等的VLP研发。
[0007]对于昆虫细胞，除部分糖基化模式(glycosylation pattern)之外，进行与哺乳动物细胞非常类似的PTM过程，可用于生产envelop VLP和no n
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envelop VLP，通常具有相比于高等细胞，蛋白质的生产量多的优点。用于研发对于流感病毒、人乳头瘤病毒等各种病毒的VLP。
[0008]对于植物细胞，虽然表达系统还没有开始研究很久，但在VLP研发方面具有很多可能性。可从源头上排除可在VLP蛋白生产中产生的病毒、癌基因、肠毒素等各种污染源，若有
用物质的需求剧增，相比于现有的动物细胞系统，批量生产所需的设备技术或费用方面绝对有利，因此，具有可在最短时间内能够以低费用批量生产的优点。此外，其具有与哺乳动物细胞类似的PTM，因此具有对于envelop VLP及non
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envelop VLP均可生产的特征。
[0009]但是，即使具有上述优点，但相比于包含动物细胞及微生物的其他宿主，在植物细胞中生产蛋白质时，相对未优化的分离纯化方法成为最大的障碍。因此，进行了大量研究，并尝试以各种方法提高植物细胞中的蛋白质的生产率。例如，根据韩国授权公报第10
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1848082号，公开了如下的内容：可通过将包含纤维素结合域3的重组载体及利用上述重组载体转化的植物体中合成的蛋白质与纤维素相结合来分离包含靶蛋白的融合蛋白，可通过在融合蛋白处理肠激酶来有效分离靶蛋白和纤维素结合域。
[0010]此外，作为能够生产靶蛋白的蛋白质分离纯化技术的另一例，根据韩国公开专利公报第10
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2015
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0113934号，公开了如下的内容：若将生理活性蛋白或肽与免疫球蛋白Fc片段结合，则相比于未结合免疫球蛋白Fc片段的生理活性蛋白或肽，具有改善生理活性蛋白或肽的溶解度的效果。
[0011]因此，根据如上所述的现有技术，在从植物体生产有用生理活性物质的情况下，具有可代替作为以往所使用的方法的利用动物细胞或微生物的生产方法的效果。第一，可缩短有用生理活性物质的生产所需的时间，还可大幅降低生产成本。第二，可从源头上排除可在动物细胞或微生物中合成的蛋白质分离纯化过程中产生的如细胞毒性的污染源；第三，在商用的情况下，能够以种子的形式长期保存，由此可节减储存及保存费用。第四，能够以安全的种子形式运输，当出现紧急需要的问题时，可快速供应给所需的地区或国家。第五，当对生理活性物质的需求剧增时，批量生产所需的生产设备及系统建设不需要太多技术，因此，容易实现批量化，相比于利用动物细胞系统的生产系统，具有可大幅降低设置费用和产品生产费用的优点，因此，可在最短时间内实现批量生产，从而可根据需求提供充足的供应。
[0012]如前所述，虽然提供了有效地从植物体合成及分离包含医学上可适用的VLP蛋白质和产业上有用的酶的有用生理活性物质的各种技术，但是每个蛋白质所具有的固有特性互不相同，因此，统一应用特定方法并不可取，所以需要进行个别研究。

技术实现思路

[0013]技术问题
[0014]本专利技术为了解决如上所述的现有技术的问题而提出，当生产在转化植物体中形成作为靶蛋白的病毒样颗粒的重组苜蓿花叶病毒(Alfalfa mosai c virus，AMV)时，为了在翻译阶段提高蛋白质的表达水平，将Rubisco传递肽(Rubisco transit peptide)与靶蛋白融合来由叶绿体靶向，并且在为了分离纯化而附着多组氨酸的情况下，可确认蛋白质的表达水平和分离纯化效率得以提高，并确认，利用其在转化植物体中大幅提高靶蛋白生产效率。
[0015]此外，通过各种实验方法确认了，若适当调节包含由如上所述的方式分离纯化的AMV的溶液的组成、pH及NaCl浓度，则形成病本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种植物体的用于表达的重组载体，其特征在于，包含：编码Rubisco传递肽的包含由SEQ ID NO.2表示的氨基酸序列的多核苷酸，以及编码苜蓿花叶病毒衣壳蛋白的包含由SEQ ID NO.4表示的氨基酸序列的多核苷酸。2.根据权利要求1所述的植物体的用于表达的重组载体，其特征在于，上述编码Rubisco传递肽的多核苷酸包含由SEQ ID NO.1表示的碱基序列，上述编码苜蓿花叶病毒衣壳蛋白的多核苷酸包含由SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.10表示的碱基序列。3.根据权利要求1所述的植物体的用于表达的重组载体，其特征在于，上述重组载体还包含编码多组氨酸标签的包含由SEQ ID NO.6表示的氨基酸序列的多核苷酸。4.根据权利要求3所述的植物体的用于表达的重组载体，其特征在于，上述多组氨酸标签连接于编码上述苜蓿花叶病毒衣壳蛋白的多核苷酸的C
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term末端或N
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term末端。5.根据权利要求3所述的植物体的用于表达的重组载体，其特征在于，上述重组载体在启动子与终止子之间，(1)依次连接有编码Rubisco传递肽的多核苷酸、编码苜蓿花叶病毒衣壳蛋白的多核苷酸以及编码多组氨酸标签的多核苷酸；或者(2)依次连接有编码Rubisco传递肽的多核苷酸、编码多组氨酸标签的多核苷酸以及编码苜蓿花叶病毒衣壳蛋白的多核苷酸。6.一种转化植物体，其特征在于，由权利要求1至5中任一项所述的重组载体转化。7.一种重组苜蓿花叶病毒衣壳蛋白的分离纯化方法，其特征在于，包括：步骤1，利用权利要求1至5中任一项所述的重组载体转化植物体；步骤2，将在上述步骤1中获得的转化植物体与蛋白质提取缓冲溶液相混合来制备植物体混合液；步骤3，从在上述步骤2获得的混合液中回收去除植物残渣的混合液；步骤4，将在上述步骤3中获得的混合液注入至填充有琼脂糖的柱，并将连接有多组氨酸标签的重组苜蓿花叶病毒衣壳蛋白吸附在上述琼脂糖中；步骤5，将洗涤溶液注入至柱来进行洗涤；以及步骤6，将洗脱溶液注入至柱，并洗脱吸附在琼脂糖中的上述重组蛋白。8.根据权利要求7所述的分离纯化方法，其特征在于，上述蛋白质提取缓冲溶液满足下述特征中的一个以上：(1)包含10mM至100mM的三羟甲基氨基甲烷、100mM至1500mM的氯化镁(MgCl2)、0.01％至1％的曲通X
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100(聚乙二醇对
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(1,1,3,3
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四甲基丁基)
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苯基醚)以及5mM至300mM的咪唑；或者(2)pH为7至9。9.根据权利要求7所述的分离纯化方法，其特征在于，上述琼脂糖为镍
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亚氨基二乙酸琼脂糖。10.根据权利要求7所述的分离纯化方法，其特征在于，上述步骤1中，利用引入上述重组载体的细菌转化植物体。
11.根据权利要求10所述的分离纯化方法，其特征在于，上述细菌为根癌土壤杆菌。12.根据权利要求7所述的分离纯化方法，其特征在于，上述植物体为选自由拟南芥、大豆、烟草、茄子、辣椒、土豆、西红柿、白菜、卷心菜以及生菜组成的组中的双子叶植物；或者选自由水稻、大麦、小麦、黑麦、玉米、甘蔗、燕麦以及洋葱组成的组中的单子叶植物。13.一种重组苜蓿花叶病毒衣壳蛋白，其特征在于，通过权利要求7所述的分离纯化方法洗脱。14.一种重组苜蓿花叶病毒病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括：步骤1，利用权利要求1至5中任一项所述的重组载体转化植物体；步骤2，将在上述步骤1中获得...

【专利技术属性】
技术研发人员：朴永民，宋秀智，闵庚民，
申请(专利权)人：巴伊沃爱普有限公司，
类型：发明
国别省市：