一种高效表达胶原蛋白水解酶的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种高效表达胶原蛋白水解酶的方法及其应用，属于生物技术领域。本发明专利技术采用含有胶原蛋白水解酶突变体的宿主细胞进行发酵，生产的胶原蛋白水解酶酶活显著提升，且在宿主菌中的可溶性表达也大幅提升，实现了胶原蛋白水解酶的高效表达，其中，胶原蛋白水解酶突变体是将来自Bacillus cereus VD021的胶原蛋白水解酶经过截短改造得到。将该酶应用于不同来源胶原蛋白的水解催化时可将胶原蛋白全部转化为低分子量胶原蛋白肽，降解效果良好，具有重要的应用前景。具有重要的应用前景。具有重要的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种高效表达胶原蛋白水解酶的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及一种高效表达胶原蛋白水解酶的方法及其应用，属于生物


技术介绍

[0002]胶原蛋白，简称胶原，是一种结构蛋白，大量存在于人体结缔组织如软骨和皮肤等的细胞外基质中，同时也是哺乳动物中含量最丰富的蛋白，约占人体总蛋白的三分之一。胶原蛋白种类繁多，目前已经发现30种不同的胶原蛋白。胶原蛋白是由原胶原也就是单个胶原分子组成的胶原纤维，而胶原分子通常是由三条左螺旋的氨基酸链以右螺旋的方式组成三螺旋结构，最常见的Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ型胶原蛋白的三螺旋结构长度约为300nm平均直径为1.5nm，氨基酸的组成却存在共同特点，三条链呈现Gly
‑
X
‑
Y的排列方式，甘氨酸残基占了总氨基酸残基的三分之一，X和Y通常分别为脯氨酸和羟脯氨酸，两者约占总氨基酸组成的四分之一。由于其特殊的三螺旋结构，天然胶原蛋白具有异常的稳定性，很难被一般的蛋白酶所降解。
[0003]低分子量的胶原蛋白的制备方法主要分为两类：化学降解法和生物酶解法。化学降解法是目前商业化生产胶原蛋白的主要方式，尽管化学法生产低分子量胶原蛋白的工艺已经十分成熟，但也存在比如破坏氨基酸结构，产品组分单一性差、环境污染等问题。相比于化学降解法，生物酶解法具有反应条件温和、无污染、工艺简单、产品分子量易于控制、不会破坏氨基酸活性基团等优势。
[0004]除了用于酶法制备低分子量胶原蛋白，胶原蛋白水解酶酶也被用于治疗清理烧伤创口、愈合伤口、缓解坐骨神经痛、治疗腰椎间盘突出、慢性完全闭塞、掌腱膜挛缩症和纤维性海绵体炎等多种疾病。目前对于胶原蛋白水解酶的研究集中在细菌来源的胶原蛋白水解酶，然而，目前市场上的商业胶原酶利用溶组织梭状芽孢杆菌发酵获得，它也是长期以来市场上唯一的微生物胶原酶，但该菌是致病菌，限制了其在食品行业的应用。且其在大肠杆菌中表达时，胶原蛋白水解酶在包涵体中，不溶现象突出，胶原酶的市场需求很大，但工业化的生产菌株仍然很少，国内市场上销售的胶原酶多为昂贵的进口胶原酶。因此研究胶原酶在微生物表达系统中的高效表达有广阔的前景。

技术实现思路

[0005]为解决上述问题，本专利技术提供了一种胶原蛋白水解酶突变体的表达方法及其在水解胶原蛋白中的应用，以来自Bacillus cereus VD021的胶原蛋白水解酶(Protein ID：R8HPH3)为出发序列进行改造，随后优化其在大肠杆菌和毕赤酵母中的重组表达，得到的胶原蛋白水解酶可高效水解胶原蛋白，将其全部降解成胶原蛋白短肽。
[0006]本专利技术的第一个目的是提供一种高效表达胶原蛋白水解酶的方法，采用含有胶原蛋白水解酶突变体的宿主细胞进行发酵生产，所述胶原蛋白水解酶突变体通过截去SEQ ID NO.1所示氨基酸序列N端的第1
‑
30位氨基酸得到。突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0007]进一步地，所述宿主细胞包括大肠杆菌或毕赤酵母。
[0008]进一步地，所述胶原蛋白水解酶突变体由SEQ ID NO.3所示的启动子或lac启动子启动表达。
[0009]进一步地，所述胶原蛋白水解酶突变体由SEQ ID NO.4所示的信号肽调控表达。
[0010]进一步地，以pET
‑
28a(+)或pRS305为表达载体。
[0011]进一步地，所述发酵为分批发酵或补料分批发酵。
[0012]进一步地，分批发酵时，包括如下步骤：将种子液接种于发酵培养基中，于28
‑
32℃、230
‑
270rpm培养2
‑
4h，后于23
‑
27℃、580
‑
620rpm下诱导表达，发酵过程中通气量保持在1.5
‑
2.0vvm，流加pH调节剂维持pH在6.8
‑
7.2直至分批发酵结束。
[0013]进一步地，补料分批发酵时，包括如下步骤：当发酵培养基中初始碳源消耗完毕时，流加甘油，速度为7
‑
9mL
·
L
‑1·
h
‑
1，直至补料分批发酵结束。
[0014]进一步地，流加的甘油浓度为60
‑
80％(w/v)。
[0015]本专利技术的第二个目的是提供一种高效表达胶原蛋白水解酶的重组菌，所述重组菌以大肠杆菌或毕赤酵母为宿主，异源表达胶原蛋白水解酶突变体，所述胶原蛋白水解酶突变体通过截去SEQ ID NO.1所示氨基酸序列N端的第1
‑
30位氨基酸得到。
[0016]进一步地，所述胶原蛋白水解酶突变体由SEQ ID NO.3所示的启动子或lac启动子启动表达。
[0017]进一步地，所述胶原蛋白水解酶突变体由SEQ ID NO.4所示的信号肽调控表达。
[0018]本专利技术的第三个目的是提供一种胶原蛋白水解酶突变体，所述胶原蛋白水解酶突变体通过截去SEQ ID NO.1所示氨基酸序列N端的第1
‑
30位氨基酸得到。
[0019]本专利技术的第四个目的是提供编码上述胶原蛋白水解酶突变体的基因。
[0020]本专利技术的第五个目的是提供携带上述基因的重组质粒。
[0021]本专利技术的第六个目的是提供表达上述胶原蛋白水解酶突变体的宿主细胞。
[0022]进一步地，所述宿主细胞为细菌、真菌、植物细胞或动物细胞。
[0023]本专利技术的第七个目的是提供上述高效表达胶原蛋白水解酶的重组菌、胶原蛋白水解酶突变体、基因、重组质粒或宿主细胞在降解胶原蛋白中的应用，尤其在制备低分子量胶原蛋白(分子量为30
‑
25Da)产品中具有良好表现。
[0024]进一步地，所述降解是在45
‑
55℃条件下反应1h～12h。
[0025]进一步地，反应体系中，胶原蛋白底物浓度为10g
·
L
‑1～20g
·
L
‑1；胶原蛋白水解酶突变体的添加量为15U
‑
100U。
[0026]本专利技术的有益效果：
[0027]本专利技术提供了一种在大肠杆菌和毕赤酵母中高效降解胶原蛋白的水解酶突变体，酶活有显著提升，且提高了该酶在重组宿主菌中的可溶性表达。用获得的突变体制备低分子量胶原蛋白，经蛋白肽结构预测发现产物中含有胶原蛋白肽组成的最小单元数三肽，证明其具有良好的降解效果，从而通过控制添加的酶量和反应的时间即可得到不同分子量含量的低分子量胶原蛋白。最后在此基础上，本专利技术对表达方法进行改进，发现在毕赤酵母中重组表达，并以甘油作为流加碳源进行分批补料发酵时，测定酶活高达38U
·
mL
‑1。
附图说明
[0028]图1为纯化后SDS
‑
PAGE电泳图。
[0029]图2为BL21
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效表达胶原蛋白水解酶的方法，其特征在于，采用含有胶原蛋白水解酶突变体的宿主细胞进行发酵生产，所述胶原蛋白水解酶突变体通过截去SEQ ID NO.1所示氨基酸序列N端的第1
‑
30位氨基酸得到。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞包括大肠杆菌或毕赤酵母。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胶原蛋白水解酶突变体由SEQ ID NO.3所示的启动子或lac启动子启动表达。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胶原蛋白水解酶突变体由SEQ ID NO.4所示的信号肽调控表达。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵为分批发酵或补料分批发酵。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，分批发酵时，包括如下步骤：将种子液接种于发酵培养基中，于28
‑
32℃、230
‑
270rpm培养2
‑
4h，后于23
‑
27℃、580
‑
620rpm下诱导表达，发酵过程中通气量保持在1.5

【专利技术属性】
技术研发人员：康振，刘平，陈坚，堵国成，李江华，王阳，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：