一种角蛋白酶及其编码基因以及用于制备角蛋白水解物的应用制造技术

本发明专利技术公开一种角蛋白酶及其编码基因以及用于制备角蛋白水解物的应用，角蛋白酶是如下(a)或(b)所示的蛋白质：(a)由序列表SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)由序列表SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或插入得到的，具有角蛋白降解活性的蛋白质。所述角蛋白酶与酸性蛋白酶顺序分批使用，降解鸡毛、猪毛等废弃角蛋白，所制备的低分子量角蛋白水解物具有两个特征分子量分布，即：3

【技术实现步骤摘要】
一种角蛋白酶及其编码基因以及用于制备角蛋白水解物的应用


[0001]本专利技术涉及酶工程领域。更具体地，涉及一种角蛋白酶及其编码基因以及利用酶催化制备精细化学品(角蛋白水解物)的应用。

技术介绍

[0002]角蛋白酶作为一种独特的蛋白酶，可以特异性水解角蛋白废弃物，如废弃羊毛，禽类羽毛和其他类型畜毛等。禽畜角蛋白副产品每年在全球范围内大量生产，但由于其结构紧密和高二硫键含量，很难处理。这种废物的积累引起了环境问题和资源浪费。相较于酸碱处理、高压蒸煮、机械喷爆等角蛋白回收利用工艺，角蛋白酶介导的角蛋白水解工艺具有条件温和、低污染排放、高效率、低加工成本等优势。
[0003]角蛋白酶可以由自然界中的多种微生物产生。这些微生物中的大多数是从富含角蛋白的环境中分离出来的，例如羽毛堆场，家禽粪便和屠宰场废物填埋场等。海洋环境也是产生角蛋白酶的菌株的重要来源，从海洋褐藻中分离出淀粉样芽孢杆菌S13，发现可产生两种角质酶。近年来，研究人员发现动物肠道消化系统还含有产生角蛋白酶的菌株。从狼蛛的肠道中分离出一种新的枯草芽孢杆菌菌株，并显示出角蛋白酶对羽毛，羊毛，杂草和油脂的降解活性。通过环境微生物中新型角蛋白的识别与功能发掘，以及已知角蛋白结构改造，可以开发出在催化效率、底物亲和性、产物专一性、条件耐受性等方面更具优势的角蛋白酶产品，服务于工农业生产。
[0004]废弃角蛋白经角蛋白酶部分或完全水解后，水溶性大幅提高。这类角蛋白水解产物的利用方式包括：(1)以氨基酸和小分子蛋白肽形式用于饲料添加剂，提供动物营养；(2)与壳聚糖、聚羟基丁酸等生物材料复合加工，制造可降解的包装与填充材料；(3)角蛋白水解物可作为功效成分应用于护发类产品如香波、护发素等。其中，角蛋白水解物作为护发功效成分的潜在作用机制包括，富含半胱氨酸的小分子角蛋白水解物可以深入毛发真皮层(Cortex)通过与皮层角蛋白之间的相互作用，改善发质。此外角蛋白水解物还可以附着于毛发表皮层(Cuticle)，防御染烫过程的发质损失，以及改善毛发的保水性等。
[0005]作为护发及个人护理品添加剂使用的角蛋白水解物产品，分子量分布至关重要，决定了该产品的主用应用场景及使用效果。通过新型角蛋白酶的筛选及水解工艺优化，制造具有特定分子量分布的角蛋白水解物具有重要的应用价值，这是由于：(1)小分子肽的活性作用取决于角蛋白的水解部位，这往往在宏观上关联于角蛋白水解物的分子量分布特征；(2)使用酶解组合工艺直接制备具有特定分子量分布的角蛋白水解物产品，能够避免采用凝胶色谱、精密超滤等昂贵的蛋白质分离纯化技术，大大降低角蛋白水解物的生产制备成本。

技术实现思路

[0006]本专利技术的一个目的在于提供一种角蛋白酶及其编码基因以及制备方法和应用，该
角蛋白酶具有水解角蛋白并产生具有特殊分子量分布角蛋白水解物的特性。
[0007]本专利技术的另一个目的在于提供上述角蛋白酶用于制备护发类角蛋白水解物的应用。
[0008]为达到上述目的，本专利技术采用下述技术方案：
[0009]本专利技术提供一种角蛋白酶，被命名为KerA
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WJ
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072。该角蛋白酶原始结构基因，克隆获取于浙江舟山污水处理厂厌氧池分离得到的一株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。原始角蛋白酶编码基因，经易错PCR介导的对Inhibitor
‑
I9结构域的随机突变，筛选得到本专利技术所述角蛋白酶蛋白酶KerA
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WJ
‑
072，即如下(a)或(b)所示的蛋白质：
[0010](a)由序列表SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0011](b)由序列表SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或插入得到的具有角蛋白降解活性的蛋白质。
[0012]其中，所述序列表SEQ ID NO.1所述氨基酸序列由381个氨基酸残基组成。
[0013]在本专利技术中上述角蛋白酶的编码基因也属于本专利技术的保护范围，所述编码基因如(a)或(b)所示：
[0014](a)如序列表SED ID NO.2所示的核苷酸序列；
[0015](b)编码如序列表SED ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。
[0016]其中，序列表SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列由1146个碱基组成(含终止子)，其编码序列为自5
’
端第1到第1146位碱基，编码如序列表SED ID NO.1所示的氨基酸序列的蛋白质。
[0017]需要注意的是，含有本专利技术上述编码基因的表达载体、细胞系、工程菌及宿主菌均属于本专利技术的保护范围。
[0018]本专利技术还提供了一种表达上述角蛋白酶的方法，是将含有上述角蛋白酶编码基因的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到角蛋白酶。
[0019]其中，所述宿主可为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物、昆虫、枯草杆菌、芽孢杆菌或乳杆菌等，优选为酵母菌。
[0020]所述酵母菌优选为巴氏德毕赤酵母(Pichia pastoris)，例如巴氏德毕赤酵母X33。
[0021]用于构建所述重组枯草杆菌载体及重组酵母菌表达载体的出发载体可为在上述宿主中表达外源基因的表达载体，用于构建重组表达载体的出发载体为pBR322、pHT01、pEB、pPIC9K、pPIC9、pGAPza载体。如可在枯草杆菌中表达的pBE
‑
S载体，以及在巴氏德毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达的pPIC9K、pPIC9、pGAPza等。
[0022]上述重组表达载体均可按常规方法构建。
[0023]本专利技术还提供了所述角蛋白酶单独或与酸性蛋白酶顺序批次使用降解角蛋白的应用。
[0024]本专利技术进一步还提供了经所述角蛋白酶与酸性蛋白酶联用，水解角蛋白制备角蛋白水解物的分子量分布特征，以及该分布特征下作为护发功效成分的应用特性。
[0025]本专利技术中，角蛋白酶的底物可以是各类禽类羽蛋白及畜类毛蛋白的单一品种或组合。优选的，所述角蛋白可以为鸡毛蛋白，猪毛蛋白。
[0026]所述角蛋白酶在与酸性蛋白酶顺序批次使用，降解废弃角蛋白，制备低分子量角
蛋白水解物的应用，包括：
[0027](a)所选废弃角蛋白为鸡毛、鸭毛、鹅毛等禽类羽蛋白以及牛毛、羊毛、猪毛等畜类毛蛋白的单一成分或混合物；
[0028](b)所选废弃角蛋白经加热前处理，提高角蛋白的催化活力的处理方法。所述前处理方法，技术特征在于常压下加热废弃角蛋白与水的混合物，加热温度60
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100℃，处理时间0.1
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6小时。
[0029](c)所选角蛋白酶催化水解温度为10
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60℃，水解pH为5
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11；
[0030](d)经角蛋白酶水解后，使用酸性蛋白酶二次水解，酸性蛋白酶为黑曲霉酸性蛋白酶、宇佐美本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种角蛋白酶，其特征在于，所述角蛋白酶是如下(a)或(b)所示的蛋白质：(a)由序列表SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)由序列表SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或插入得到的具有角蛋白降解活性的蛋白质。2.如权利要求1所述角蛋白酶的编码基因。3.一种如权利要求2所述角蛋白酶的编码基因，其特征在于，所述角蛋白酶的编码基因如(a)或(b)所示：(a)如序列表SED ID NO.2所示的核苷酸序列；(b)编码如序列表SED ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。4.含有权利要求2或3所述的编码基因的表达载体、细胞系、工程菌或宿主菌。5.一种表达权利要求1所述的角蛋白酶的制备方法，其特征在于，将含有权利要求2或3所述的角蛋白酶的编码基因的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到角蛋白酶。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，用于构建重组表达载体的出发载体为pBR322、pHT01、pEB、pPIC9K、pPIC9或pGAPza载体。7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述宿主为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物、昆虫、枯草杆菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴珊，金薇，
申请(专利权)人：杭州中科理化生物医药技术有限公司，
类型：发明
国别省市：