一种二联体DNA四面体结构及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提出了一种二联体DNA四面体结构及其制备方法和应用。本发明专利技术所述的二联体DNA四面体包括第一DNA四面体结构、第二DNA四面体结构和连接链。该结构能够特异性识别两种细胞表面蛋白，并通过荧光进行标记；同时由于结构的空间位阻作用，使两种蛋白之间难以靠近，影响了两者之间相互作用。该结构能较长时间的存在于细胞表面，因而对这两种细胞膜表面的蛋白具有较好的细胞调控效果，具体体现在降低HER2蛋白的磷酸化水平，促进细胞凋亡相关的蛋白的表达，并最终导致了肿瘤细胞凋亡，降低了肿瘤细胞的细胞活性。胞的细胞活性。胞的细胞活性。

【技术实现步骤摘要】
一种二联体DNA四面体结构及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于荧光结构和肿瘤检测
，尤其涉及一种二联体DNA四面体结构、所述结构的制备方法及其在肿瘤细胞检测中的应用。

技术介绍

[0002]本部分的陈述仅仅是提供了与本专利技术相关的
技术介绍
信息，不必然构成在先技术。
[0003]DNA分子可与无机纳米材料结合，如修饰在金表面、量子点上或者装载在介孔纳米颗粒中，用于细胞内的癌症生物标志物分析。除此之外，由DNA链组装而成的结构由于具有较好的生物相容性、优秀的抗降解稳定性以及可控的形状、尺寸和易于被细胞内吞等优势，为生物分析提供了更多的机会。基于DNA结构的分析方法已被广泛应用于细胞内蛋白质、离子以及miRNA等的灵敏检测。
[0004]膜蛋白位于细胞表面，在可变性和数量上表现出复杂性，这些改变都可能与导致不同的细胞身份相关，发生癌变的细胞其膜上普遍存在着异常表达的蛋白。与细胞内基因组或转录标记分子(如RNA或DNA)相比膜蛋白具有出色的可及性和特异性，因此是早期肿瘤的准确检测和诊断的优异候选者。
[0005]HER2是人表皮生长因子受体家族中的一个成员，其他成员还包括ErbB1、HER3、HER4，这类受体通过蛋白二聚进而激活多种下游的信号通路，进而调控细胞的增殖和生长。正常的细胞中这类家族蛋白的含量很低，而在许多肿瘤细胞中HER2蛋白过表达十分常见，特别是乳腺癌细胞中，这种异常在约30％的病例中发现，导致了肿瘤细胞不受控制的增殖。核仁素是一种癌细胞表面普遍存在的蛋白质，参与细胞增殖和生长的基本过程。绝大多数的癌细胞表面核仁素水平均有升高，并参与细胞致瘤性转化和癌症发展。已有的研究发现，细胞表面核仁素的过表达增强了核仁素与HER2蛋白之间的相互作用，并且可以激活HER2受体及其调控的信号通路，这与肿瘤细胞生长有着密切关系，因此靶向这两种细胞膜表面的蛋白可能实现对细胞行为的调控。
[0006]目前基于核酸适配体识别细胞表面膜蛋白的方法已被广泛地开发和应用，许多工作证明了核酸适配体链具有较好的细胞识别特异性和一定的调控能力，但单纯的DNA链不可避免的存在稳定性和集成性差的不足，导致假性信号的存在并限制调控效果。

技术实现思路

[0007]为克服上述现有技术的不足，本专利技术提供了一种二联体DNA四面体结构(dimer
‑
TDN)，其能够与肿瘤细胞表面的目标蛋白特异性结合，可以更加灵敏的检测肿瘤细胞表面的目标蛋白或细胞表面蛋白提取物，表现出对肿瘤细胞较好的识别特异性；另外，二联体DNA四面体结构(dimer
‑
TDN)能够对目标蛋白的空间位置进行一定调控，进而调控细胞生命历程。本专利技术还提供了二联体DNA四面体结构(dimer
‑
TDN)的制备方法及其在细胞识别和调控细胞生命历程中的应用。
[0008]本专利技术中，专利技术人提供了一种集成了两种适配体的二联体DNA四面体结构(dimer
‑
TDN)。该结构由连接有HER2蛋白和核仁素蛋白(NCL)的适配体DNA四面体通过连接链连接构成。连接链上修饰有荧光基团和淬灭基团，荧光基团因与淬灭集团位置接近而被淬灭。
[0009]两种适配体借助细胞膜流动性，能协同且特异性地结合到细胞表面的目标蛋白上。这种特异性的结合使得dimer
‑
TDN上标记的淬灭基团被解封，荧光基团荧光恢复用于细胞识别；同时与目标蛋白结合上的dimer
‑
TDN由于存在着空间位阻作用，使两种蛋白之间难以靠近，影响了两者之间相互作用，该结构能较长时间的存在于细胞表面，因而对这两种细胞膜表面的蛋白具有较好的细胞调控效果，具体体现在与降低HER2蛋白的磷酸化水平，促进细胞凋亡相关的蛋白的表达，并最终导致了肿瘤细胞凋亡，降低了肿瘤细胞的细胞活性。本专利技术中二联体DNA四面体结构(dimer
‑
TDN)不仅可以实现肿瘤细胞特异性识别，还能通过改变细胞表面蛋白相对位置进而实现对细胞的有效调控，有助于为相关疾病的诊治提供新的研究思路。
[0010]具体地，本专利技术的技术方案如下所示：
[0011]本专利技术的第一方面，本专利技术一种二联体DNA四面体结构，所述二联体DNA四面体结构包括第一DNA四面体结构、第二DNA四面体结构和连接链；
[0012]所述第一DNA四面体结构由四条单链DNA S1、S2、S3、S4及BN构成，所述S4含有目标蛋白的适配体域；所述BN能够与S4适配体域碱基互补配对；
[0013]所述第二DNA四面体结构由四条单链DNA S1、S2、S3
’
、S4
’
及BH构成，所述S4
’
含有目标蛋白的适配体域；所述BH能够与S4
’
适配体域碱基互补配对；
[0014]所述连接链由三条单链DNA S5、S6及S7构成；
[0015]所述S6连接第一DNA四面体结构和第二DNA四面体结构，所述S6同时与S5序列互补；所述S7与S5序列互补；所述S5和S7还分别与BH、BN互补；所述S5和S6碱基互补的一端分别修饰有淬灭基团和发光基团。
[0016]在本专利技术的一些实施方式中，所述S1
‑
S4序列如SEQ ID NO.1
‑
4所示；所述S3
’
、S4
’
序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；所述BN序列如SEQ ID NO.7所示；所述BH序列如SEQ ID NO.8所示；所述S5序列如SEQ ID NO.9所示；所述S6序列如SEQ ID NO.10所示；所述S7序列如SEQ ID NO.11所示。
[0017]在本专利技术的一些实施方式中，所述S5的5
’
端修饰有淬灭基团；所述S6的3
’
端修饰有发光基团；进一步，所述发光基团为Cy3；所述淬灭基团为BHQ。
[0018]本专利技术的第二方面，本专利技术提供上述第一方面所述二联体DNA四面体结构(dimer
‑
TDN)的制备方法，其包括，将第一DNA四面体结构、第二DNA四面体结构及连接链等比例混合，共同孵育，组装获得二联体DNA四面体结构。
[0019]所述孵育条件为：35℃
‑
38℃孵育3
‑
6h；具体的，所述孵育条件为：37℃孵育4h。
[0020]在本专利技术的一些实施方式中，所述第一DNA四面体结构的制备方法为：将构成四面体的单链DNA S1，S2，S3，S4，BN按照1：1：1：1：1的摩尔比在TAE
‑
Mg
2+
缓冲溶液中进行混合，混合液在90
‑
98℃加热3
‑
10min后冷却至室温即得；优选地，所述混合液在95℃条件下加热5min，之后缓慢冷却至室温；
[0021]或，所述第二DNA四面体结构的制备方法为：本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种二联体DNA四面体结构，其特征在于，所述结构包括第一DNA四面体结构、第二DNA四面体结构和连接链；所述第一DNA四面体结构由四条单链DNA S1、S2、S3、S4及BN构成，所述S4含有目标蛋白的适配体域；所述BN能够与S4适配体域碱基互补配对；所述第二DNA四面体结构由四条单链DNA S1、S2、S3
’
、S4
’
及BH构成，所述S4
’
含有目标蛋白的适配体域；所述BH能够与S4
’
适配体域碱基互补配对；所述连接链由三条单链DNA S5、S6及S7构成；所述S6连接第一DNA四面体结构和第二DNA四面体结构，所述S6同时与S5序列互补；所述S7与S5序列互补；所述S5和S7还分别与BH、BN互补；所述S5和S6碱基互补的一端分别修饰有淬灭基团和发光基团。2.如权利要求1所述的一种二联体DNA四面体结构，其特征在于，所述S1
‑
S4序列如SEQ ID NO.1
‑
4所示；所述S3
’
、S4
’
序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；所述BN序列如SEQ ID NO.7所示；所述BH序列如SEQ ID NO.8所示；所述S5序列如SEQ ID NO.9所示；所述S6序列如SEQ ID NO.10所示；所述S7序列如SEQ ID NO.11所示。3.如权利要求2所述的一种二联体DNA四面体结构，其特征在于，所述S5的5
’
端修饰有淬灭基团；所述S6的3
’
端修饰有发光基团；进一步，所述发光基团为Cy3；所述淬灭基团为BHQ。4.权利要求1
‑
3任一项所述二联体DNA四面体结构的制备方法，其特征在于，包括，将第一DNA四面体结构、第二DNA四面体结构及连接链等比例混合，共同孵育，组装获得二联体DNA四面体结构。所述孵育条件为：35℃
‑
38℃孵育3
‑
6h；具体的，所述孵育条件为：37℃孵育4h。5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述第一DNA四面体结构的制备方法为：将构成四面体的单链DNA S1，S2，S3，S4，...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐晓文，张瑞雪，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：