一种重组人源制造技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，涉及一种重组人源

【技术实现步骤摘要】
一种重组人源
Ⅶ
型胶原蛋白及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，涉及一种重组人源
Ⅶ
型胶原蛋白及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]胶原蛋白是人体内最丰富的蛋白质家族，占人体总蛋白质的30％，是皮肤、肌肉、骨骼和结缔组织等的重要组成部分。
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型胶原蛋白主要由角质形成细胞和成纤维细胞合成。它作为一种锚定原纤维主要成分，能结合I型和III型胶原蛋白，为间质膜和基底膜结构提供稳定性，对维持细胞外基质的功能和稳定性至关重要。
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型胶原蛋白功能突变会引起大疱性表皮松解症，导致患者皮肤在受到摩擦或碰撞后易出现水疱及血疱，是一种严重影响身心健康的皮肤疾病。
[0003]Ⅶ
型胶原蛋白包括2944个氨基酸，由中间胶原结构域和两侧的非胶原NC
‑
1和NC
‑
2结构域组成。中间胶原结构域呈现典型的胶原蛋白Gly
‑
X
‑
Y重复序列结构。相对其它胶原蛋白家族，在
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型胶原蛋白三螺旋结构域中，有一段39个氨基酸构成的“铰链”区域，该区域容易受到胃蛋白酶的蛋白水解消化。
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型胶原蛋白非胶原NC
‑
1结构域大小约为145kDa，由粘附蛋白结构域组成，包括软骨基质蛋白、九个连续的III型纤连蛋白样结构域、血友病因子结构域以及富含半胱氨酸和脯氨酸的区域。羧基末端非胶原结构域NC
‑
2相对较小，大约30kDa，包含一个与Kunitz蛋白酶抑制分子同源结构域。
[0004]Ⅶ
型胶原蛋白对维持皮肤、肌肉细胞外基质的功能和稳定性至关重要，因此在化妆美容产品和相关运动医学材料领域受到青睐。然而由于
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型胶原胶原蛋白的全长分子量较大，体外重组表达难度极高，因此目前研究者通常截取
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型胶原蛋白中的三螺旋结构序列，进行全化学合成或重组表达。全化学合成的胶原蛋白往往较小，无法获得人们理想的胶原蛋白分子量。在建立重组表达体系时，研究者还可能会在编码框设计时添加纯化标签和分泌肽信号序列残留，导致最终获得的胶原蛋白并非完全人源化的
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型胶原蛋白。因此，设计开发简单操作、快速制备完全人源化
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型胶原蛋白的表达体系有着一定的研究价值和应用前景。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种完全人源化
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型胶原蛋白的表达制备体系。
[0006]基于上述目标，本专利技术提供了一种重组人源
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型胶原蛋白及其制备方法与应用来满足本领域内的这种需要。
[0007]一方面，本专利技术涉及一种重组人源
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型胶原蛋白，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1；
[0008]或氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0009]另一方面，本专利技术涉及多核苷酸，所述多核苷酸编码氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质。
[0010]进一步地，本专利技术提供的多核苷酸中，所述多核苷的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0011]另一方面，本专利技术涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含上述的多核苷酸。
[0012]另一方面，本专利技术涉及毕赤酵母蛋白载体，其选用pPICZ质粒，删除所述pPICZ质粒中α
‑
factor分泌信号肽的Glu
‑
Ala
‑
Glu
‑
Ala重复序列，将如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列序列克隆至所述信号肽的序列羧基端。
[0013]另一方面，本专利技术涉及工程菌或细胞，所述工程菌或细胞包含上述的重组表达载体，或上述的毕赤酵母蛋白载体。
[0014]进一步地，本专利技术提供的工程菌或细胞中，所述工程菌或细胞的宿主为毕赤酵母。
[0015]另一方面，本专利技术涉及重组人源
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型胶原蛋白的制备方法，其包括：将上述的毕赤酵母蛋白载体，加入PemⅠ限制性内切酶，制备线性化DNA；
[0016]将所述线性化DNA通过电转化置入毕赤酵母GS115中，筛选得到分泌表达所述重组人源
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型胶原蛋白的菌株；
[0017]采用甲醇诱导所述菌株表达制得所述重组人源
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型胶原蛋白。
[0018]本专利技术与现有技术相比有以下优点：
[0019]本专利技术基于
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胶原蛋白的理化性质和三维预测结构，选取
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胶原蛋白中亲水性良好的片段(1357
‑
1931)。同时设计改造质粒中的信号肽序列，将所述人源
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型胶原蛋白的基因片段插入穿梭质粒中，使其编码的胶原蛋白为完全人源化序列，不含任何标签和外源氨基酸序列。随后将质粒线性化，电转化毕赤酵母GS115，通过高浓度抗生素快速筛选得到高效稳定表达的重组工程菌。后续经过发酵条件优化，确定高效稳定表达的菌株。
[0020]本专利技术方法简单操作，快速高效，在短时间内就能筛选出高效表达的工程菌，专利技术方法所提供的完全人源
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型胶原蛋白具有良好的亲水性，并且随着发酵时间增加，在诱导表达第9天未出现明显的降解，稳定性好，易于后续工业放大生产。并且专利技术所述
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型胶原蛋白的不含有任何重组表达标签和外源氨基酸序列，表达的蛋白序列只来源于人
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型胶原蛋白氨基酸序列，在美容化妆品、护肤品和相关生物医学材料领域等有应用潜力。
附图说明
[0021]图1为专利所述VII型胶原蛋白片段(1357
‑
1931位)氨基酸疏水性分析图。
[0022]图2为pPICZ
‑
Col7A质粒图谱。
[0023]图3为改造后信号肽序列。
[0024]图4为pPICZ
‑
Col 7A质粒线性化结果。第1个泳道是DNA Marker，第2个泳道是酶切后样品，第3个泳道是未酶切质粒pPICZ
‑
Col7A。
[0025]图5为重组工程菌表达5天样品蛋白电泳图。第1个泳道为BSA 2μg对照组，第2个泳道为蛋白电泳Marker，第3
‑
12组分别为10个筛选菌株的VII胶原蛋白表达结果，第4泳道为专利所述菌株VII胶原蛋白表达结果。
[0026]图6为菌株表达量VII胶原蛋白电泳图。第1个泳道为蛋白电泳Marker,第2个泳道为诱导前，第3个泳道为诱导表达第3天，第4个泳道为诱导表达第4天，第5个泳道为诱导表达第5天，第6个泳道为诱导表达第7天，第7个泳道为诱导表达第9天，第8个泳道为BSA对照上样0.50μg，第9个泳道为BSA对照上样1μg，第10个泳道为BSA对照上样1.5μg，第11个泳道
为BSA对照上样2μg。
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组人源
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型胶原蛋白，其特征在于，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1；或氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。2.多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质。3.根据权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。4.重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求2或3中任一项所述的多核苷酸。5.毕赤酵母蛋白载体，其特征在于，选用pPICZ质粒，删除所述pPICZ质粒中α
‑
factor分泌信号肽的Glu
‑
Ala
‑
Glu
‑
Ala重复...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯钰，高波，温瑷嘉，柯欢欢，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：