一种烈性嗜水气单胞菌噬菌体制造技术

本发明专利技术公开了一种烈性嗜水气单胞菌噬菌体，其拉丁名为Aeromonas hydrophila phage，命名为P05B，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期为2023年6月9日，保藏编号为GDMCC No.63552

【技术实现步骤摘要】
一种烈性嗜水气单胞菌噬菌体


[0001]本专利技术涉及微生物
，特别涉及一种新的烈性嗜水气单胞菌噬菌体。

技术介绍

[0002]嗜水气单胞菌是一种革兰氏阴性的嗜热细菌，广泛存在于世界各地的养殖环境中。它也是一种条件致病菌，当环境达到特定条件时，会引起养殖动物大量死亡。据报道，嗜水气单胞菌对多种重要的经济养殖品种均有危害，如鱼、虾、蟹、龟鳖和蛙等。嗜水气单胞菌的致病过程一般为粘附、入侵、定殖、增殖、产毒等五个步骤。该菌种间的毒力差异较大，可分为致病性和非致病性菌株，其致病力与携带的毒力因子种类、数量相关。目前，抗生素还是预防和治疗嗜水气单胞菌感染的首选方案，但是随着可用抗生素品种的减少、耐药菌的出现及传播，亟待开发抗生素代替技术。
[0003]噬菌体是一类具有极强专一性，能够感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称，最早于1915年由英国生物学家发现。据估计，全球约有10
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种噬菌体，其在调节环境及动物肠道微生物种群方面发挥着关键作用。噬菌体分为烈性噬菌体和温和噬菌体，前者可在敏感宿主菌内增殖并使之裂解，亦称为毒性噬菌体，特异性杀灭病原菌。烈性噬菌体侵入细菌体内，主要是利用宿主的合成机制，对细菌的细胞壁施加压力，破坏细菌的代谢，导致细菌溶解和破裂，随后释放噬菌体。与其他治疗手段相比，噬菌体治疗具有安全、可靠、高效、快速、经济、实用等特点，有望成为一种较好的抗菌药物，尤其是在治疗耐药性细菌感染方面。但是，目前针对嗜水气单胞菌的噬菌体较少，尤其是具有强裂解能力的烈性噬菌体。/>
技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种新的烈性嗜水气单胞菌噬菌体，对多株嗜水气单胞菌均有较强裂解效果，可用于养殖环境或者动物体内嗜水气单胞菌的防控。
[0005]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种烈性嗜水气单胞菌噬菌体，其拉丁名为Aeromonas hydrophila phage，命名为P05B，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期为2023年6月9日，保藏编号为GDMCC No.63552
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B1。本专利技术对该噬菌体和所形成噬菌斑的形态进行观察，结合基因组测序及比较结果，确定为一种新的嗜水气单胞菌烈性噬菌体。
[0006]所述的烈性嗜水气单胞菌噬菌体在制备防治嗜水气单胞菌的生物制剂中的应用。
[0007]一种预防和治疗嗜水气单胞菌感染的生物制剂，所述生物制剂的有效成分为所述的烈性嗜水气单胞菌噬菌体。
[0008]本专利技术的有益效果是：对多株嗜水气单胞菌均有较强裂解效果，可用于养殖环境或者动物体内嗜水气单胞菌的防控。
[0009]本专利技术测定噬菌体P05B对宿主菌的抑制情况，确定在7h内，宿主菌浓度仍处于较低水平。噬菌体P05B经双层平板法以7株嗜水气单胞菌为对象，测定出噬菌体P05B可以裂解
其中的5株嗜水气单胞菌，裂解率为71.4％，这一结果说明该噬菌体对嗜水气单胞菌裂解谱广，在临床治疗上具有良好的应用前景。
附图说明
[0010]图1 本专利技术的噬菌体噬菌斑效果图；图2 本专利技术的噬菌体的电子显微镜图；图3 本专利技术的噬菌体对不同温度的敏感曲线图；图4 本专利技术的噬菌体对不同pH的敏感曲线图；图5 本专利技术的噬菌体体外生长动力学图；图6 本专利技术的噬菌体体外裂解不同株嗜水气单胞菌效果图；图7 本专利技术的噬菌体体外抑菌OD600曲线图；图8 本专利技术的噬菌体基因组序列图。
具体实施方式
[0011]下面通过具体实施例，对本专利技术的技术方案作进一步的具体说明。
[0012]本专利技术中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
[0013]实施例1：嗜水气单胞菌噬菌体的筛选和纯化（1）样品的采集本专利技术中的水样样品于2022年3月采集于浙江省嘉兴市某罗氏沼虾育苗场。
[0014]（2）样品中针对嗜水气单胞菌噬菌体的特异性扩增取10 mL水样经离心过滤后加入到5 mL 3
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Trypticase Soy Broth （市售，TSB肉汤）之中，再加入嗜水气单胞菌500 μL，混匀后28℃，200 rpm震荡过夜培养。
[0015]（3）双层平板法检测噬菌体的存在配制琼脂含量为1.5％的TSB营养琼脂固体培养基（海博生物），高压灭菌之后，室温放置至约40~60℃后取10
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15 mL倾倒至培养皿内，均匀铺于培养皿底，室温放置30 min使其凝固，将此TSB营养琼脂作为底层琼脂。取上述嗜水气单胞菌与水样样品的混合培养液，12000 rpm离心5 min，上清经0.22 μm滤器过滤除菌后备用。取100 μL滤液与100 μL的嗜水气单胞菌混合后28℃孵育5 min，加入已高压灭菌并冷却至55℃的5 mL琼脂含量为0.7％的TSB半固体营养琼脂培养基（海博生物）。手搓试管混匀后，迅速倒入己准备好的底层琼脂平板上，旋转平皿使其分布均匀成上层琼脂。待琼脂凝固后，28℃倒置过夜培养，观察有无噬菌斑。如果有则进行步骤4；以上操作均在无菌条件下进行。
[0016]噬菌斑观察结果为：噬菌斑为圆形透亮的斑点，直径约为1~3 mm，见图1。
[0017]（4）噬菌体样品的纯化抠取步骤(3)中获得的单个噬菌斑，放入1 mL的SM缓冲液（Phygene）之中，加入数颗灭菌陶瓷珠，28℃震荡1 h，然后12000 rpm离心5 min，取上清过滤液经十倍稀释至合适的稀释度，通过双层平板法进行噬菌斑的纯化，连续纯化3次，获得大小与形态一致的噬菌斑。得到噬菌体单克隆单体，并将该噬菌体命名为P05B。
[0018]（5）噬菌体样品的扩增
抠取步骤(4)中纯化完的单斑，放入1 mL的SM缓冲液之中，加入数颗灭菌陶瓷珠，28℃震荡1 h，然后12000 rpm离心5 min，上清经0.22 μm滤器过滤除菌后备用。取100 μL上清滤液，加入10 mL已培养至对数生长期早期（OD600=0.3~0.6）的嗜水气单胞菌菌液中，28℃恒温摇床200 rpm培养5 h，待培养液澄清，得到噬菌体增殖液。
[0019]（6）噬菌体保存液的制备将噬菌体增殖液与已高压灭菌的含50％甘油的TSB营养肉汤液体培养基（海博生物）以1:1的比例混合，即得到噬菌体保存液。噬菌体保存液于
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80℃保存。
[0020]实施例2：嗜水气单胞菌噬菌体的形态观察噬菌体的电镜观察采用磷钨酸负染法。取10
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L噬菌体浓缩液滴加到铜网上吸附1 min，用滤纸吸去多余的液体，加1滴2%的磷钨酸染色1 min，用滤纸吸去多余的染色液，自然干燥后使用Hitachi H7650型透射电镜在80 kV下观察。使用Nano Measure 1.2软件对噬菌体进行测量。
[0021]电镜观察结果为：噬菌体P05B是一株肌尾噬菌体，有一个正二十面体对称的头部，直径约57.9 nm，有一个长约1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种烈性嗜水气单胞菌噬菌体，其特征在于：其拉丁名为Aeromonas hydrophila phage，命名为P05B，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期为2023年6月9日，保藏编号为GDMCC No.63552
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【专利技术属性】
技术研发人员：吕孙建，刘莉，沈卫锋，韩明明，郭琦，熊富磊，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：