鼠伤寒沙门氏工程菌YB1在扩增噬菌体中的应用制造技术

本发明专利技术属于微生物领域，涉及噬菌体的扩增和培养，更具体涉及鼠伤寒沙门氏工程菌YB1在扩增噬菌体中的应用。本发明专利技术发现鼠伤寒沙门氏工程菌YB1在机体内不能增殖，具有较高的安全性。通过使用沙门氏菌YB1扩增噬菌体，扩增后噬菌体经电镜观察均属于有尾噬菌体目，效价与初始相近。因而，使用工程菌YB1扩增效率和培养都优于传统沙门氏菌，这为噬菌体工艺化开发提供了新的方法。了新的方法。

【技术实现步骤摘要】
鼠伤寒沙门氏工程菌YB1在扩增噬菌体中的应用


[0001]本专利技术属于微生物领域，涉及噬菌体的扩增和培养，更具体涉及鼠伤寒沙门氏工程菌YB1在扩增噬菌体中的应用。

技术介绍

[0002]噬菌体是一类可以感染细菌的病毒，是病毒中最为普遍、分布最为广泛的群体。通常情况下，充满细菌群落的地方，如饲养场、动物胃肠道等都可以找到噬菌体。噬菌体的繁殖与细菌宿主密切相关。目前，噬菌体的分离和扩增主要通过分离和已经建立的致病菌来获取。虽然很多致病菌已经实施了脱毒，但在一定条件下仍存在反毒和独立增强的风险。
[0003]沙门氏菌（Samlonelal）属于肠杆菌科，革兰氏阴性肠道杆菌，是沙门氏菌病的病原体。沙门氏菌病多数是人和动物共同的致病菌，通过食用受沙门氏菌污染的肉、乳、蛋等可能导致人的发病，主要引起食物中毒和败血症等。沙门氏菌可以在普通培养基中生长，为需氧兼厌氧性菌，对环境抵抗力较强，流行于世界各国，对幼畜、雏禽为害甚大，成年畜禽多呈慢性或隐性感染，是畜禽养殖过程中需要重点防控的病原菌。
[0004]现有技术中存在的问题是：1）沙门氏菌具有致病性，繁殖存活能力强，在分离和扩增噬菌体时会对人体和环境造成一定危害。2）以沙门氏菌为宿主菌培养或扩增噬菌体时，可能残留在扩培噬菌体中，在使用噬菌体过程中，促使致病菌感染动物和人体，造成为危害。3）沙门氏菌为需氧兼厌氧性菌，在有氧条件下，更具有增殖优势，而给工艺化生产造成一定难度。
[0005]鼠伤寒沙门氏工程菌YB1是可商业化购买的菌株，其主要用于肿瘤抑制方面探索，为探索治疗肿瘤开发使用的材料。
[0006]目前并没有人使用其扩增噬菌体，本专利技术人发现通过使用商业化沙门氏菌YB1扩增噬菌体效率和培养都优于传统沙门氏菌，这为噬菌体工艺化开发提供了新的方法。

技术实现思路

[0007]采用条件性诱导增殖的“专性”厌氧鼠伤寒沙门氏工程菌YB1，一方面工程沙门氏菌YB1增殖是有条件的，是将沙门氏菌关键酶ASD置于缺氧诱导启动子来控制表达，ASD可以编码一种合成沙门氏菌细胞壁必须成分DAP，该酶本身在哺乳动物系统中不存在。所以在添加DAP条件下，可以促使沙门氏菌YB1增殖，当不添加时，由于ASD仅在缺氧条件下表达，该细菌能够在缺氧条件下生长，在正常有氧条件下无法增殖。因此，沙门氏YB1工程菌从兼性厌氧菌转变为专性厌氧菌，使其在动物组织中是安全的，无法实现复制。另外，工程沙门氏菌YB1作为一种专性厌氧菌，在工艺化生产噬菌体时也降低了工艺难度，促进产业化生产。为此本专利技术研究探索以鼠伤寒沙门氏菌YB1来扩增和培养噬菌体，获得显著的扩增效率和培养效果，由此完成本专利技术。
[0008]本专利技术提供一种鼠伤寒沙门氏工程菌YB1在培养或扩增噬菌体中的应用。
[0009]优选地，所述噬菌体是沙门氏噬菌体或大肠杆菌噬菌体。
[0010]本专利技术进一步提供一种利用鼠伤寒沙门氏工程菌YB1在培养或扩增噬菌体的方法，其包括如下步骤：第一步，将噬菌体加入到鼠伤寒沙门氏工程菌YB1培养液中，振荡培养6
‑
8 h得到培养液；第二步，将所述培养液离心得上清液，并过滤器过滤除菌，收集噬菌体液。
[0011]在具体实施方式中，所述振荡培养是置于37℃摇床160 rpm/min振荡培养6
‑
8 h。
[0012]在一个具体实施方式中，鼠伤寒沙门氏工程菌YB1培养液的制备方法如下：将鼠伤寒沙门氏工程菌YB1菌落添加至补充有DAP和氯霉素的液体LB培养基中，置于37℃摇床180 rpm/min振荡培养至对数期。
[0013]更具体地，鼠伤寒沙门氏工程菌YB1菌落的培养方法为：在冷却至50℃的PH=7.0的LB琼脂培养基中加入40
‑
60μg/mL的 DAP和20
‑
30 μg/mL的氯霉素，充分混匀后制备琼脂平板；将鼠伤寒沙门氏工程菌YB1从
‑
20℃取出，放置冰上溶解，取部分菌液涂板，室温静置15 min，随后倒置于37℃培养箱中过夜培养获得菌落。
[0014]优选实施方式中，第一步中无菌挑取鼠伤寒沙门氏工程菌YB1菌落，接种于含50 μg/mL的DAP和25 μg/mL的氯霉素的液体LB培养基中，37℃振荡培养，使细菌处于对数生长期；以感染复数（MOI）为10
‑2加入噬菌体，37℃继续培养至细菌完全裂解。
[0015]具体地，第二步的具体操作如下：将所述培养液以4℃、10000 rpm/min、10 min条件离心三次，取离心后的上清液过0.22 μm过滤器过滤除菌，收集噬菌体液。
[0016]优选地，所述噬菌体是沙门氏噬菌体或大肠杆菌噬菌体。
[0017]与现有技术相比，本专利技术技术方案具有以下优点：促使噬菌体分离，培养和产业化生产变得更加安全和简单，促进沙门氏菌噬菌体产业化扩增更简单。且噬菌体在生产应用中更加安全，不会存在致病菌残留等问题。
附图说明
[0018]图1 鼠伤寒沙门氏工程菌YB1体外增殖时细菌生长曲线。
[0019]图2鼠伤寒沙门氏工程菌YB1体内安全性评价。
[0020]图3鼠伤寒沙门氏工程菌YB1平板扩增噬菌体实验。其中，NC：阴性对照；SaPA
‑
1~SaPA
‑
15：为沙门噬菌体库中15种沙门氏菌噬菌体；Es
‑
PA
‑
1为大肠杆菌沙门氏菌体。
[0021]图4 鼠伤寒沙门氏工程菌YB1扩增噬菌体电镜检测。其中，A：SaPA
‑
1；B：SaPA
‑
2；C：SaPA
‑
3。
具体实施方式实施例1. 鼠伤寒沙门氏工程菌YB1细菌扩增、活力检测
[0022]在鼠伤寒沙门氏工程菌YB1培养过程中，通过添加DAP体外可以促进鼠伤寒沙门氏工程菌YB1体外稳定增殖。将工程菌YB1均匀涂布在含DAP（50 μg/mL）和氯霉素（25 μg/mL）的LB琼脂培养基上，室温静置，待菌液干燥后倒置于37℃细菌培养箱中过夜培养，观察细菌菌落生长状况。挑取工程菌YB1菌落，添加至补充有50 μg/mL的 DAP和25 μg/mL的氯霉素的液体LB培养基中，37℃摇床180 rpm/min振荡培养。每间隔培养2 h，取菌液2 μL，利用紫外分光光度计测定吸光度OD620值来确定细菌数（1 OD = 1
×
10
9 CFU）。该曲线具有典型的S
型生长曲线，对数生长期8
‑
14h的鼠伤寒沙门氏工程菌YB1具有最佳活力（图1）。
实施例2. 检测各脏器细菌分布
[0023]通过尾静脉静脉注射小鼠，每只注射107CFU的鼠伤寒沙门氏工程菌YB1。在接种后的1
‑
7天内，每天随机选择小鼠安乐死，剖检，分离肝脏、脾脏、肾脏和肺脏，通过CFU检测各组织内细菌数。将4种组织在LB液中均质，随后在添加抗生素和D本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.鼠伤寒沙门氏工程菌YB1在培养或扩增噬菌体中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述噬菌体是沙门氏噬菌体或大肠杆菌噬菌体。3.一种利用鼠伤寒沙门氏工程菌YB1在培养或扩增噬菌体的方法，其包括如下步骤：第一步，将噬菌体加入到鼠伤寒沙门氏工程菌YB1培养液中，振荡培养6
‑
8 h得到培养液；第二步，将所述培养液离心得上清液，并过滤器过滤除菌，收集噬菌体液。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述振荡培养是置于37℃摇床160 rpm/min振荡培养6
‑
8 h。5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，鼠伤寒沙门氏工程菌YB1培养液的制备方法如下：将鼠伤寒沙门氏工程菌YB1菌落添加至补充有DAP和氯霉素的液体LB培养基中，置于37℃摇床180 rpm/min振荡培养至对数期。6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，鼠伤寒沙门氏工程菌YB1菌落的培养方法为：在冷却至5...

【专利技术属性】
技术研发人员：白银山，胡智超，刘芳，陈慧芳，朱翠，刘定发，刘凯，黄文诗，曾四发，
申请(专利权)人：汕尾市现代畜牧产业研究院，
类型：发明
国别省市：