一种菌株多因素影响下的分离与鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种菌株多因素影响下的分离与鉴定方法，包括如下步骤：取生产有机农药后的排放污水进行驯化和富集培养，得到富集液；取所述富集液涂布于LB固体培养基上，以获得多种菌落；向96孔无菌PCR板的孔中，依次加入A份无菌MSM、单个所述菌落，混合均匀，再依次加入B份无菌MSM、有机农药的水溶液，以制得混合液；对所述混合液进行震荡培养，以制得反应液；取所述反应液，加入C份无菌MSM稀释，离心处理，取上清液，以得到样品；对上所述样品依次进行紫外分光光度计扫描，吸收峰形状发生变化的所述样品内含有降解菌株。发明专利技术提高了有效菌株的筛选效率，通过减少反应体系、提高单次实验通量，缩短降解菌株验证的时间，成本降低。成本降低。成本降低。

【技术实现步骤摘要】
一种菌株多因素影响下的分离与鉴定方法


[0001]本专利技术涉及环境工程与微生物工程领域，具体涉及一种菌株多因素影响下的分离与鉴定方法。

技术介绍

[0002]现有一种利用微生物降解环境中化学农药污染的方法，主要是利用有机农药成为碳源，接种能够分解此种农药的菌株，并通过分离与鉴定来筛选出接种能够分解此种农药的菌株，是一种非常经济且有效的方法。
[0003]而如何分离能够降解此种农药的菌株以及鉴定菌株的降解能力、生长环境等成为热门课题。
[0004]为了分离出降解菌株并鉴定菌株的降解因素与所需环境，常用的方法为在MSM平板中添加农药溶液，在LB平板中添加农药溶液，以及在LB平板中不添加农药溶液来稀释涂布筛选农药的降解菌株，但在实际培养分离的过程中，由于需要LB扩大培养去验证降解功能，导致验证的时间长，工作量大，筛选的成功率低。
[0005]其次，由于需要进行扩大培养，在分离与鉴定时，其培养体系过大，导致每次挑单菌验证的工作量增加，包括试剂和耗材的准备，在培养设备中占用的空间大，单次筛选出的样本少，而影响菌株的生长因素多，导致其鉴定效率低。
[0006]现需要一种能够快速大量分离与鉴定菌株的方法，从而进一步提高对有机农药降解单菌筛选的成功率。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种菌株多因素影响下的分离与鉴定方法，以解决现有技术中降解菌株的分离与鉴定效率低下的技术问题。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术具体提供下述技术方案：
[0009]本专利技术提供了一种菌株多因素影响下的分离与鉴定方法，包括如下步骤：
[0010]取富集液用无菌水梯度稀释，然后分别取各梯度的所述富集液涂布于LB固体培养基上，对固体培养基进行培养，以获得多种菌落；
[0011]向96孔无菌PCR板中的孔中，依次加入A份无菌MSM、单个所述菌落，混合均匀，再依次加入B份无菌MSM、有机农药的水溶液，以制得混合液；
[0012]其中，不同浓度梯度所述富集液制得的所述菌落放置在所述PCR板不同的孔中，得到不同的所述混合液；
[0013]对所述混合液进行震荡培养，以制得反应液；
[0014]取所述反应液，加入C份无菌MSM稀释，离心处理，取上清液，以得到样品；
[0015]对上所述样品依次进行紫外分光光度计扫描，吸收峰形状发生变化的所述样品内含有降解菌株。
[0016]作为本专利技术的一种优选方案，所述A份无菌MSM为10μL，所述B份无菌MSM为185μL。
[0017]作为本专利技术的一种优选方案，在所述混合液中，所述有机农药的浓度为250mg/L；
[0018]其中，所述有机农药的水溶液的体积为5μL，浓度为10g/L。
[0019]作为本专利技术的一种优选方案，所述有机农药为对氯苯氧乙酸钠。
[0020]作为本专利技术的一种优选方案，所述震荡培养包括如下步骤：
[0021]所述PCR板封膜处理，放置在150rpm的旋转震荡培养箱中培养5天；
[0022]其中，所述混合液的pH为7.0，所处的环境温度为30℃。
[0023]作为本专利技术的一种优选方案，所述反应液的体积与所述C份无菌MSM的体积比为15：85。
[0024]作为本专利技术的一种优选方案，所述离心处理满足以下条件：转速为12000rpm，时间为1min；
[0025]所述扫描的波长范围为200
‑
350nm。
[0026]作为本专利技术的一种优选方案，所述富集液的稀释梯度为10 ‑4，10 ‑5，10
‑6，10 ‑7。
[0027]作为本专利技术的一种优选方案，所述固体培养基的培养包括如下步骤：
[0028]分别取10 ‑4，10 ‑5，10 ‑6，10 ‑7各浓度梯度的所述富集液100μL，涂布于LB固体培养基上；
[0029]将所述LB固体培养基置于35℃下恒温培养1
‑
2天，以获得多种所述菌落。
[0030]本专利技术与现有技术相比较具有如下有益效果：
[0031]本专利技术不用LB扩大培养去验证降解功能，直接从平板中挑取单菌至含有MSM中培养验证，节省了中间LB培养再收菌体的操作，可以缩短验证的时间，同时也大大减少了工作量。
[0032]本专利技术使用的体系减少，试剂和耗材的使用量大大减少，在培养设备中占用的空间也很少，成本降低；本专利技术在不增加操作步骤的基础上，单次可以得到大量样本，通量增加；专利技术一次筛选的单菌数量多，成功筛选有效降解菌的效率大大提升。
[0033]本专利技术在此分离方法与鉴定方法能够用于多种农药降解菌株的分离与鉴定，在实际操作上为有机农药的生物分解领域提供了一种新的且高效的分离以及鉴定方法，提高了生物分解领域在分解有机农药中的应用范围。
附图说明
[0034]为了更清楚地说明本专利技术的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
[0035]图1为本专利技术提供一种菌株多因素影响下的分离与鉴定方法的流程示意图；
[0036]图2为本专利技术提供实施例中对氯苯氧乙酸钠降解富集液的紫外扫描图谱；
[0037]图3为本专利技术提供图2所示实施例中的96孔PCR板筛选对氯苯氧乙酸钠降解菌株的紫外扫描图谱；
[0038]图4为本专利技术提供图2所示实施例中的纯化菌株降解对氯苯氧乙酸钠的紫外扫描图谱；
[0039]图5为本专利技术提供图2所示实施例中的纯化后的降解菌株单菌形态图；
[0040]图6为本专利技术提供对氯苯氧乙酸钠标准曲线；
[0041]图7为本专利技术提供降解过程的紫外扫描图谱和HPLC图谱；
[0042]图8为本专利技术提供对氯苯氧乙酸钠的降解曲线；
具体实施方式
[0043]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0044]在筛选降解对氯苯氧乙酸钠的单菌时，运用现有的方法，比如在MSM平板中添加50mg/L的对氯苯氧乙酸钠，在LB平板中添加50mg/L的对氯苯氧乙酸钠，以及在LB平板中不添加50mg/L的对氯苯氧乙酸钠来稀释涂布筛选对氯苯氧乙酸钠降解菌株，均未能筛选出稳定降解对氯苯氧乙酸钠的单菌。推测有可能是培养基缺少某些物质，比如微量元素，在MSM中添加微量元素进行培养后紫外扫描发现仍然没有降解的功能。同时也推测是有可能由2种甚至多种微生物同时起作用，因此测试不同的单菌混合验证，仍然没有发现降解的功能。
[0045]产生上述问题的主要原因为菌本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种菌株多因素影响下的分离与鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：取富集液用无菌水梯度稀释，然后分别取各梯度的所述富集液涂布于LB固体培养基上，对固体培养基进行培养，以获得多种菌落；向96孔无菌PCR板中的孔中，依次加入A份无菌MSM、单个所述菌落，混合均匀，再依次加入B份无菌MSM、有机农药的水溶液，以制得混合液；其中，不同浓度梯度所述富集液制得的所述菌落放置在所述PCR板不同的孔中，得到不同的所述混合液；对所述混合液进行震荡培养，以制得反应液；取所述反应液，加入C份无菌MSM稀释，离心处理，取上清液，以得到样品；对上所述样品依次进行紫外分光光度计扫描，吸收峰形状发生变化的所述样品内含有降解菌株。2.根据权利要求1所述的一种菌株多因素影响下的分离与鉴定方法，其特征在于，所述A份无菌MSM为10μL，所述B份无菌MSM为185μL。3.根据权利要求1所述的一种菌株多因素影响下的分离与鉴定方法，其特征在于，在所述混合液中，所述有机农药的浓度为250mg/L；其中，所述有机农药的水溶液的体积为5μL，浓度为10g/L。4.根据权利要求3所述的一种菌株多因素影响下的分离与鉴定方法，其特征在于，所述有机农药为对氯苯氧乙酸钠。5.根据权利要求1所述的一种菌株多因素影响下的分离...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘诗燕，刘辉超，刘洪明，
申请(专利权)人：上海信诺佰世医学检验有限公司，
类型：发明
国别省市：