一种CHO细胞来源的外泌体miRNA在调控重组蛋白表达中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种CHO细胞来源的外泌体miRNA在调控重组蛋白表达中的应用，本发明专利技术属于生物医药技术领域。本发明专利技术提供的一种CHO细胞来源的外泌体miRNA在调控重组蛋白表达中的应用中所述miRNA为cgr

【技术实现步骤摘要】
一种CHO细胞来源的外泌体miRNA在调控重组蛋白表达中的应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，尤其涉及一种CHO细胞来源的外泌体miRNA在调控重组蛋白表达中的应用。

技术介绍

[0002]生物药物在制药行业所占的比重日益增加，其中重组蛋白类药物因其极强的靶向特异性运用于多种疾病的诊断与治疗。近70％的重组蛋白药物是由中国仓鼠卵巢(Chinese hamsterovary,CHO)细胞表达产生的。然而，CHO细胞在无血清培养基中往往出现细胞活力差、分泌外源蛋白能力弱等问题，使得哺乳动物细胞生产重组蛋白药物成本高且周期长。
[0003]为了满足治疗性重组蛋白在治疗各种疾病和临床应用方面日益增长的需求，在细胞系开发、培养基组成和培养条件优化方面的研究均取得了显著进展，但仍然无法完全满足市场需求。
[0004]近年来，外泌体因其在健康和疾病中的重要作用以及其在治疗和诊断中的潜在临床应用而备受关注。几乎所有类型的细胞都能分泌外泌体，外泌体携带了参与细胞内信号转导的蛋白质、mRNA、miRNA和脂质类物质，参与细胞活动的重要调控过程。研究发现外泌体不仅可以增强CHO细胞培养过程中抗凋亡活性，还能降低无血清悬浮培养细胞的成本。然而有关CHO细胞外泌体miRNA的研究鲜有报道。
[0005]miRNA参与细胞分裂、死亡、代谢和组织分化等一系列细胞过程，CHO细胞miRNA与重组蛋白生产相关的细胞特性密切相关，比如细胞生长、凋亡、代谢、糖基化和表观遗传等。外泌体miRNA能够参与调控基因表达，可作为细胞间通讯的潜在调控因子，被认为是生物制药生产细胞系优化的潜在靶标。
[0006]外泌体miRNA的功能大致可以分为两种类型：一种是常规功能，即miRNA对靶基因表达水平进行调控，使靶基因表达水平发生特异性变化；另一种是在一些外泌体miRNA而非胞内miRNA中发现的新功能。目前尚无CHO细胞来源的外泌体miR
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3p对重组蛋白表达的相关研究。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种CHO细胞来源的外泌体miRNA在重组蛋白表达中的应用，为生产重组蛋白类药物提供一种新途径。
[0008]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0009]本专利技术提供了一种CHO细胞来源的外泌体miRNA在调控重组蛋白表达中的应用，所述miRNA为cgr
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miR
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3p。
[0010]优选的，所述cgr
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miR
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3p的核酸序列如SEQ ID NO.1(5
’‑
ACAGGCCGGGACAAGUGCAAUA
‑3’
)所示。
[0011]优选的，扩增所述cgr
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miR
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‑
3p的引物探针组序列如SEQ ID NO.2～4所示。
[0012]Forwardprimer:5
’‑
GCGTATTGCACTTGTCCCG
‑3’
(SEQ ID NO.2)
[0013]Reverse primer:5
’‑
AGTGCAGGGTCCGAGGTATT
‑3’
(SEQ ID NO.3)
[0014]RT Primer:5
’
[0015]‑
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACA CAGGC
‑3’
(SEQ ID NO.4)
[0016]优选的，所述CHO细胞为CHO
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S或CHO
‑
K1。
[0017]优选的，所述重组蛋白为阿达木抗体。
[0018]优选的，通过下调所述外泌体miRNA的表达水平，提高所述阿达木抗体的表达水平。
[0019]本专利技术发现转染miRNA inhibitor下调CHO细胞来源的外泌体miR
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3p水平，阿达木抗体(重组蛋白)的表达水平显著升高，有望提供一种提高CHO细胞重组蛋白表达的新方法。
附图说明
[0020]图1为实施例1中EGFP稳定高/低表达CHO细胞外泌体透射电镜图。
[0021]图2为实施例1中EGFP稳定高/低表达CHO细胞外泌体NTA图。
[0022]图3为实施例1中EGFP稳定高/低表达CHO细胞外泌体标志蛋白Westernblot结果。
[0023]图4为实施例1中EGFP稳定高/低表达CHO细胞外泌体中miR
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‑
3p表达水平。
[0024]图5为实施例2中流式细胞术检测下调miR
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3p水平对EGFP表达水平的影响。
[0025]图6为实施例3中下调miR
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3p水平对CHO细胞活细胞密度的影响。
[0026]图7为实施例3中ELISA检测下调miR
‑
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3p水平对阿达木抗体表达量的影响。
具体实施方式
[0027]下面结合实施例对本专利技术提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本专利技术保护范围的限定。
[0028]以下实施例中所用CHO细胞为CHO
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S，购自Gibco公司；所用外泌体miR
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3p inhibitor和inhibitor NC购自GenePharma公司。
[0029]实施例1
[0030]检测CHO细胞来源的外泌体中miR
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3p的表达水平
[0031](1)构建EGFP稳定表达细胞
[0032]选择处于对数生长期的CHO细胞，以每孔2
×
105个细胞接种到24孔培养板中，当细胞融合度达到80～90％时，使用Lipofectamine
TM
2000转染试剂进行EGFP质粒转染。转染48h后，使用杀稻瘟菌素(15μg/mL)加压筛选至未转染细胞全部死亡，然后使用杀稻瘟菌素(10μg/mL)加压筛选2周得到细胞池。将获得的细胞池采用有限稀释法进行单克隆细胞株筛选，得到EGFP稳定高表达和低表达细胞。
[0033](2)细胞培养
[0034]使用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基培养EGFP稳定高表达和低表达CHO细胞于10cm细胞培养皿中，将细胞培养皿放置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。待细胞密度达到70％时，吸出细胞培养基，PBS洗后使用含10％无外泌体血清的DMEM/F12培养基继本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种CHO细胞来源的外泌体miRNA在调控重组蛋白表达中的应用，其特征在于，所述miRNA为cgr
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miR
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3p。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述cgr
‑
miR<...

【专利技术属性】
技术研发人员：张玺，王耀坤，郭潇，王天云，王小引，贾岩龙，张俊河，林艳，米春柳，
申请(专利权)人：新乡医学院，
类型：发明
国别省市：