本发明专利技术提供一种高纯度胶原蛋白及其制备方法和应用，所述制备方法包括如下步骤：(1)将动物身上的结缔组织进行病毒灭活处理，得到病毒灭活组织；(2)将所述病毒灭活组织进行脱细胞处理，得到胶原蛋白基质；(3)将所述胶原蛋白基质浸泡于酸溶液中，并加入胃蛋白酶进行酶解，得到酶解液，将酶解液进行离心，收集上清液；(4)将所述上清液进行二次盐析，收集沉淀，将沉淀进行透析、冷冻干燥、灭菌后，得到所述高纯度胶原蛋白。本发明专利技术采用质地较薄的结缔组织，洗涤液渗入的较为彻底可以使非胶原蛋白物质去除完全，保障了胶原蛋白的纯度；本发明专利技术采用两步盐析法，得到高纯度、低免疫原的胶原蛋白。白。
【技术实现步骤摘要】
一种高纯度胶原蛋白及其制备方法和应用
[0001]本专利技术属于蛋白质加工
，具体涉及一种高纯度胶原蛋白及其制备方法和应用。
技术介绍
[0002]胶原蛋白是一种天然的生物高分子材料，是由3条肽链组成的具有三维螺旋结构的纤维状蛋白质，其广泛存在于哺乳动物体内，是细胞外基质中最重要的组成成分，在生物医药、化妆品、食品中均有广泛应用。胶原蛋白一般是从动物真皮、肌腱、基底膜等富含胶原蛋白的动物组织中提取，提取法包括酸法、碱法和酶解法，酸法或碱法提取存在环境污染重且得率低的问题，而酶解法反应条件温和且提取效率高，成为目前主要的制备方法。
[0003]CN102131403A公开了一种高纯度胶原蛋白的制备方法，通过先制造胶原蛋白基质，然后再由基质萃取出胶原蛋白，其先将动物的结缔组织用酸浸泡膨胀后再清洗去除非胶原蛋白物质，但是在洗涤的过程中会连同酸溶性胶原蛋白共同去除而造成损失，且利用溶液溶出胶原蛋白再进行萃取的方法效率和产率比较低。
[0004]CN105063148A公开了一种以牛皮为主要原料来制备胶原蛋白的制备方法。首先匀浆消化、吸附过滤、超滤浓缩换缓冲液、离子交换层析、超滤浓缩换保存液、过滤除菌制备胶原蛋白原液，再通过蛋白沉淀、离心、匀浆纤维后获得胶原蛋白。但是其酶解温度过低使酶解周期过长(7
‑
10天)，并且利用离子层析来提高纯度的方法生产成本较高，过程复杂。
[0005]CN109207545公开了公开一种胶原蛋白提取方法，包括：
①
牛跟腱解冻，去血水、表面异物和筋膜，用溶液进行一次预处理；
②
步骤一处理的牛跟腱去脂肪膜，用溶液进行二次预处理；
③
步骤二处理完的牛跟腱冷冻后切片，用溶液进行前处理；
④
将前处理完的牛跟腱切片持续酶解，离心取上清制备胶原粗提液；
⑤
调节胶原粗提液PH，加入中性盐盐析，离心获得胶原蛋白沉淀；
⑥
加入磷酸盐缓冲液溶解上述沉淀，获得特定浓度的胶原蛋白。但是，该方法由于原料本身结构致密且处理时间较短，非胶原物质不易去除完全，同时酶解温度过低，酶解效率和胶原蛋白产率偏低。
[0006]现有技术中制备胶原蛋白的主要步骤包括：原料前处理、酶解、纯化、冷冻干燥等，由于提取技术工艺参数的不同，目前胶原蛋白纯度大多在95％以下。总体来讲，现有提取技术工艺复杂，生产成本高，纯度有待提高。并且，从动物组织中提取的胶原蛋白存在动物源免疫原性物质，该免疫原性物质能否充分去除是值得关注的问题，因此，开发一种高纯度、低免疫原性、低生产成本的胶原蛋白制备方法，是本领域的研究重点。
技术实现思路
[0007]针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种高纯度胶原蛋白及其制备方法和应用，制备得到的胶原蛋白具有纯度高、免疫原性低的特点。
[0008]为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0009]第一方面，本专利技术提供一种高纯度胶原蛋白的制备方法，所述制备方法包括如下
步骤：
[0010](1)取动物身上的结缔组织进行病毒灭活处理，得到病毒灭活组织；
[0011](2)将所述病毒灭活组织进行脱细胞处理，得到胶原蛋白基质；
[0012](3)将所述胶原蛋白基质裁切后浸泡于酸溶液中，并加入胃蛋白酶进行酶解，得到酶解液，将酶解液进行离心，收集上清液；
[0013](4)将所述上清液调节pH至中性，进行一次盐析，收集沉淀a，将所述沉淀a溶于酸性溶液，进行二次盐析，收集沉淀b，将沉淀b进行透析、冷冻干燥、灭菌后，得到所述高纯度胶原蛋白。
[0014]本专利技术采用动物身上的结缔组织包括真皮组织、皮下组织、韧带、筋腱、腱膜、腹膜、软骨以及骨头组织等，将结缔组织做削薄处理，洗涤液渗入的较为彻底可以使非胶原蛋白物质去除完全，保障了胶原蛋白的纯度；采用酸性条件进行酶解，目的是得到无端肽胶原蛋白溶液；再经过对盐析时的条件、顺序、盐浓度等因素进行筛选，本专利技术采用两步盐析法，先中性再酸性的条件对胶原蛋白溶液进行盐析纯化，得到高纯度、低免疫原的胶原蛋白。
[0015]优选地，所述结缔组织的厚度≤5mm，例如可以为4.5mm、4mm、3.5mm、3mm、2.5mm、2mm、1.5mm、1mm、0.5mm等。
[0016]优选地，所述病毒灭活处理采用的试剂为过氧化物溶液。
[0017]所述过氧化物溶液中的过氧化物包括过氧乙酸和/或过氧化氢。
[0018]优选地，所述过氧化物溶液中过氧化物的质量百分含量为0.2
‑
0.6％，例如可以为0.3％、0.4％、0.5％等。
[0019]优选地，所述结缔组织与过氧化物溶液的质量体积比为1:(20
‑
30)，例如可以为1:22、1:24、1:26、1:28等，以结缔组织为1g计，过氧化物溶液的体积为20
‑
30mL。
[0020]优选地，所述病毒灭活处理的时间为1
‑
3h，例如可以为1.2h、1.4h、1.6h、1.8h等。
[0021]优选地，所述脱细胞处理的时间为6
‑
30h，例如可以为7h、9h、11h、13h、15h、17h、19h、21h、23h、25h、27h、29h等。
[0022]优选地，所述脱细胞处理采用的试剂包括无机碱溶液、蛋白酶溶液、有机溶剂溶液或表面活性剂溶液中的任意一种或至少两种的组合。
[0023]优选地，所述脱细胞处理采用的试剂为无机碱溶液、蛋白酶溶液和有机溶剂溶液的组合。
[0024]优选地，所述脱细胞处理采用的试剂为无机碱溶液、表面活性剂溶液和有机溶剂溶液的组合。
[0025]优选地，所述无机碱溶液的处理时间为4
‑
7h，例如可以为4.5h、5h、5.5h、6h、6.5h等。
[0026]优选地，所述蛋白酶溶液的处理时间为1.5
‑
5h，例如可以为2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h等。
[0027]优选地，所述有机溶剂溶液的处理时间为6
‑
10h，例如可以为7h、8h、9h等。
[0028]优选地，所述表面活性剂溶液的处理时间为1.5
‑
5h，例如可以为2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h等。
[0029]所述脱细胞处理的程度较为彻底，更有利于后续胶原蛋白的提纯，其中，无机碱溶液作用是去杂蛋白；蛋白酶溶液或表面活性剂的作用是脱细胞中的DNA残片，有机溶剂溶液
的作用是脱脂。
[0030]优选地，所述碱溶液中的碱包括碳酸钠、碳酸氢钠或氢氧化钠中的任意一种或至少两种的组合。
[0031]优选地，所述碱溶液中的碱的质量百分含量为0.2
‑
0.8％，例如可以为0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％等。
[0032]优选地，所述蛋白本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种高纯度胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：(1)取动物身上的结缔组织进行病毒灭活处理，得到病毒灭活组织；(2)将所述病毒灭活组织进行脱细胞处理，得到胶原蛋白基质；(3)将所述胶原蛋白基质裁切后浸泡于酸性溶液中，并加入胃蛋白酶进行酶解，得到酶解液，将酶解液进行离心，收集上清液；(4)将所述上清液调节pH至中性，进行一次盐析，收集沉淀a，将所述沉淀a溶于酸性溶液，进行二次盐析，收集沉淀b，将沉淀b进行透析、冷冻干燥、灭菌后，得到所述高纯度胶原蛋白。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述病毒灭活处理采用的试剂为过氧化物溶液；优选地，所述结缔组织与过氧化物溶液的质量体积比为1:(20
‑
30)；优选地，所述病毒灭活处理的时间为1
‑
3h。3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述脱细胞处理的时间为6
‑
30h；优选地，所述脱细胞处理采用的试剂包括无机碱溶液、蛋白酶溶液、有机溶剂溶液或表面活性剂溶液中的任意一种或至少两种的组合；优选地，所述脱细胞处理采用的试剂为无机碱溶液、蛋白酶溶液和有机溶剂溶液的组合；优选地，所述脱细胞处理采用的试剂为无机碱溶液、表面活性剂溶液和有机溶剂溶液的组合。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述酸溶液中酸的质量百分含量为5
‑
20％；优选地，所述胃蛋白酶的添加量为0.5
‑
3.0g/L；优选地，所述酶解的温度为15
‑
30℃，时间为10
‑
30h。5.根据权利要求1
‑
4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述一次盐析时氯化钠的添加量为2
‑
5mol/L；优选地，所述一次盐析时氯化钠的添加量为2.2
‑
2.8mol/L。6.根据权利要求1
‑
5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述二次盐析时氯化钠的添加量为0.5
‑
2mol...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴卫东，赵海丽，张菁，李春明，李晓萌，殷敬华，
申请(专利权)人：上海珀原医用材料有限公司，
类型：发明
国别省市：
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