结核分枝杆菌特异性的重组融合蛋白E35及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种结核分枝杆菌特异性的重组融合蛋白E35。所述重组融合蛋白包含蛋白ESAT6和蛋白PE35，作为变态反应原，可以灵敏、特异地检测结核分枝杆菌感染并可有效区分结核分枝杆菌感染和卡介苗接种。利用该重组融合蛋白开发的结核分枝杆菌感染检测试剂能够兼顾IGRA检测的特异性以及传统TST检测的灵敏度与适应于大规模筛查的简便性，是具有应用和开发潜力的新一代LTBI筛查和诊断的产品。发潜力的新一代LTBI筛查和诊断的产品。

【技术实现步骤摘要】
结核分枝杆菌特异性的重组融合蛋白E35及其应用


[0001]本专利技术属于医学检测
，具体而言，本专利技术涉及一种结核分枝杆菌特异性融合蛋白及其在结核分枝杆菌感染检测中的应用。

技术介绍

[0002]根据世界卫生组织(WHO)估算，当前全球约有17亿人感染了结核分枝杆菌，约占全球总人口的23％。在感染了结核分枝杆菌的人群(Latent Tuberculosis Infection，LTBI)中，约有10％
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15％的人在一生中的某个时候会发展为结核病，因此对于结核潜伏感染人群的筛查与预防是结核病防治的重要手段。
[0003]目前对结核潜伏感染者筛查主要有γ
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干扰素释放试验(IGRA)或结核菌素皮试(TST)两类方法。IGRA操作复杂，价格昂贵，不适合大规模人群筛查和贫困地区使用；而传统TST的特异性低，不能区别卡介苗接种与结核杆菌感染，因此需要引入新的、特异性强、操作简便的筛查方法，甄别人群中的结核分枝杆菌感染者。
[0004]本领域还采用基因工程技术制备重组结核分枝杆菌蛋白或融合蛋白作为新一代的结核菌素，来筛查结核分枝杆菌感染。这类检测方法一般为基于结核分枝杆菌早期分泌蛋白(ESAT6)和结核分枝杆菌培养过滤蛋白(CFP10)为抗原开发的皮肤试验方法，通常采用ESAT6和CFP10的混合物或由二者制成的融合蛋白。ESAT6全称为“the 6kDa early secreted antigenic target produced by Mycobacterium tuberculosis”，是活动性结核感染相关的主要抗原，由大小为288bp的Rv3875基因编码(Genbank：886209)，此基因位于结核杆菌基因组的RD1中。CFP10由Rv3874基因编码，和ESAT6受同一个启动子调控转录，其蛋白也属于ESAT
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6家族的成员之一，两者具有相同的免疫学特性。ESAT6和CFP10这2个蛋白在卡介苗和绝大部分环境分枝杆菌中都缺失，因此相对于基于传统蛋白纯化衍生物(purified protein derivative，PPD)的检测方法，基于这两个蛋白的检测方法对结核菌感染具有相对更高的特异性。
[0005]但是已有大量研究提示，基于这两个蛋白为抗原的检测或筛查方法存在较大的安全隐患。在目前以ESAT6和CFP10作为抗原的检测试剂中，蛋白组分的含量相对于传统PPD产品要高得多。通常情况下，变态反应原含量越高，越容易引发机体的超敏反应；而已经感染结核的或体质敏感的受试者，在低蛋白量的情况下即有可能发生过敏反应。特别是CFP10，有动物实验研究结果显示，在大剂量应用时，CFP10可引起结核菌素休克；并且，还有研究表明CFP10可刺激TNF
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alpha产生，也提示了CFP10作为抗原蛋白的不利之处。但同时，降低试剂中的蛋白含量会导致其灵敏度显著降低。
[0006]因此，本领域仍然存在对新型结核分枝杆菌感染检测试剂的需求。

技术实现思路

[0007]本专利技术要解决的技术问题是提供一种新的结核分枝杆菌感染检测试剂，其利用作为变态反应原的新型融合蛋白，在低蛋白用量的情况下以高灵敏度、高特异性检测、诊断或
筛查结核分枝杆菌感染，并且有效区分结核分枝杆菌感染和卡介苗接种；同时应具有使用安全、简便的优势。
[0008]针对以上问题，本专利技术的一个目的是提供一种融合蛋白，该融合蛋白作为变态反应原，可以灵敏、特异地检测结核分枝杆菌感染并可有效区分结核分枝杆菌感染和卡介苗接种。本专利技术的另一个目的是提供包含编码该融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子、包含该核酸分子的重组载体以及包含该重组载体或被该重组载体转化或转染的宿主细胞。本专利技术的另一个目的是提供制备该融合蛋白的方法。本专利技术的再一个目的是提供该融合蛋白、核酸分子、重组载体或宿主细胞在制备用于检测结核分枝杆菌感染的试剂中的用途。本专利技术的又一个目的是提供包含该融合蛋白、核酸分子、重组载体或宿主细胞的用于检测、筛查或诊断结核分枝杆菌感染的试剂盒。
[0009]用于实现上述目的的技术方案如下：
[0010]一方面，本专利技术提供一种重组融合蛋白，所述重组融合蛋白包含蛋白ESAT6和蛋白PE35。具体而言，由这两个蛋白相融合形成。
[0011]PE35是由结核分枝杆菌的RD1区Rv3872基因编码的蛋白质，由99个氨基酸组成。PE35属于PE，和PPE68(Rv3873基因编码的蛋白，属于PPE家族)协同作用，与肺结核感染后的细胞免疫反应相关，能够刺激巨噬细胞产生细胞因子。PE35可以引起CD4和CD8的反应。PE35含有T
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细胞表面抗原，并且可以刺激γ
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干扰素释放试验(IGRA)中γ
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干扰素或者γ
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干扰素诱导的IP10的分泌。PE35在卡介苗和常见的环境结核杆菌中缺失。
[0012]优选地，在本专利技术提供的重组融合蛋白中，蛋白ESAT6的氨基酸序列与蛋白PE35的氨基酸序列之间经由连接序列(linker)相连接。根据本专利技术的具体实施方式，按照所述重组融合蛋白的N端至C端的顺序，蛋白ESAT6的氨基酸序列处于蛋白PE35的氨基酸序列的N端，形成N
’‑
ESAT6
‑
linker
‑
PE35
‑
C
’
的结构；或者，蛋白ESAT6的氨基酸序列处于蛋白PE35的氨基酸序列的C端，形成N
’‑
PE35
‑
linker
‑
ESAT6
‑
C
’
的结构。
[0013]更优选地，在本专利技术提供的重组融合蛋白中，蛋白ESAT6的氨基酸序列处于N端，经由连接序列与处于C端的蛋白PE35的氨基酸序列相连接。根据本专利技术的具体实施方式，所述蛋白ESAT6包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列；和/或，所述蛋白PE35包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。
[0014]本专利技术的上下文中使用的术语“同一性”是指两个氨基酸序列(或下文的核苷酸序列)的相似性。“同一性”可以使用本领域公知算法或软件对两个序列进行对比而确定，用百分比(％)表示。
[0015]本专利技术的上下文中使用的术语“至少85％同一性”是指不小于85％的任意数值(不限于整数)的同一性百分比，例如至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、乃至100％同一性。此外，所述“至少85％同一性”所形成的至多1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组融合蛋白，所述重组融合蛋白包含蛋白ESAT6和蛋白PE35。2.根据权利要求1所述的重组融合蛋白，其特征在于，在所述重组融合蛋白中，蛋白ESAT6的氨基酸序列与蛋白PE35的氨基酸序列之间经由连接序列(linker)相连接。3.根据权利要求1或2所述的重组融合蛋白，其特征在于，按照所述重组融合蛋白的N端至C端的顺序，蛋白ESAT6的氨基酸序列处于蛋白PE35的氨基酸序列的N端，形成N
’‑
ESAT6
‑
linker
‑
PE35
‑
C
’
的结构；或者，蛋白ESAT6的氨基酸序列处于蛋白PE35的氨基酸序列的C端，形成N
’‑
PE35
‑
linker
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ESAT6
‑
C
’
的结构。4.根据权利要求1至3中任一项所述的重组融合蛋白，其特征在于，蛋白ESAT6的氨基酸序列处于N端，经由连接序列与处于C端的蛋白PE35的氨基酸序列相连接；优选地，所述蛋白ESAT6包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列；和/或，所述蛋白PE35包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。5.根据权利要求1至4中任一项所述的重组融合蛋白，其特征在于，在所述重组融合蛋白中，所述连接序列为富含GS的柔性连接序列；优选地，所述连接序列包含一个或多个GGGSG，例如(GGGSG)n，n＝1
‑
5，优选n＝1
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵雁林，刘二勇，郭守杰，朱兵清，刘春法，王彦儒，
申请(专利权)人：安博智联苏州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：