荧光探针、多通道检测试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了荧光探针、多通道检测试剂盒及方法，属于生物检测技术领域。所述探针为一球体结构，包括：等离激元纳米颗粒，包裹于所述等离激元纳米颗粒的二氧化硅层，以及按照预定需求分布在二氧化硅层外壁的抗体；所述二氧化硅层的预定位置处嵌入有荧光物质。本发明专利技术中用荧光的差值作为生物标志物浓度的相关系数，解决了对绝对荧光强度的依赖，产品的批次差异减小；实现了便携式均相免疫荧光检测，避免了层析方法易受环境干扰等弊端；采用等离激元增强荧光，荧光强度相对初始荧光提升在100～10000倍的提升，检测精密度高。检测精密度高。检测精密度高。

【技术实现步骤摘要】
荧光探针、多通道检测试剂盒及方法


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及荧光探针、多通道检测试剂盒及方法。

技术介绍

[0002]免疫荧光目前主流技术可分为两大类：非均相免疫荧光和均相免疫荧光。非均相免疫荧光以荧光免疫层析技术为代表，荧光免疫层析检测技术是基于抗原抗体特异性免疫反应的膜检测技术。该技术以固定有检测线(包被抗体或包被抗原)和质控线(抗抗体)的条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，荧光标记抗体或抗原固定于连接垫，通过毛细管作用使待分析物在层析条上移动。对于带有多个抗原决定簇的大分子抗原(蛋白、病毒、致病菌等)，通常采用“三明治”型双抗夹心免疫层析方法，即待测物在流动相作用下先与荧光标记抗体结合，当到达检测线时再与包被抗体结合形成双抗夹心的“三明治”型。均相荧光免疫测定是根据1972年Rubenstein等建立的均相酶免疫测定法(HEI)发展形成的一种免疫荧光分析技术。所谓“均相”是指抗原和抗体的结合在同一液体介质环境中，这样极大增加了抗原抗体的捕获效率。均相荧光免疫测定是利用荧光的一些特殊的理化特性(如荧光的激发、吸收、淬灭等)，在标记抗原与特异性抗体结合后发生改变，据此设计建立的各种试验方法。
[0003]在这两类免疫荧光技术中，非均相免疫荧光主要利用的是层析技术，该方法学适合便携式现场检测，可以应用到基层检验场景，设备的成本相对较低。但由于层析收到环境影响较大，检测器件和荧光本身的灵敏度受限，以及固液捕获的效率不高，因此荧光免疫层析技术检测准确性相对不高。此外，小分子抗原与荧光标记抗体结合后，由于空间位阻作用难以再与检测线上的包被抗体结合。
[0004]然而，均相免疫荧光一般是配合自动化的仪器使用，该方法学抗原抗体的捕获效率很高，仪器能够精确加样、清洗、温浴、检测等，检测结果比较准确，灵敏度较高。但受限于自动化仪器，产品的使用场地受限，仪器成本较高，故障率得不到保障。如何在均相体系下发展便携式高灵敏免疫荧光检测技术是当前学术及产业界的难题。

技术实现思路

[0005]专利技术目的：为了解决上述问题，本专利技术提供了荧光探针、多通道检测试剂盒及方法。
[0006]技术方案：荧光探针，所述探针为一球体结构，包括：等离激元纳米颗粒，包裹于所述等离激元纳米颗粒的二氧化硅层，以及按照预定需求分布在二氧化硅层外壁的抗体；所述二氧化硅层的预定位置处嵌入有荧光物质。
[0007]在进一步的实施例中，相邻两组的荧光探针上的抗体通过抗原产生耦合作用。
[0008]在另一个技术方案中，提供了所述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
[0009]步骤一、制备内核：取粒径在40～100nm之间的金属纳米颗粒，对其进行氧化还原反应得到等离激元纳米颗粒内核；
[0010]步骤二、于等离激元纳米颗粒内核外表面包裹二氧化硅层得到等离激元纳米颗粒@SiO2：采用水解三氨基丙基三乙氧基硅烷制备而成，水解时间为10～30min，三氨基丙基三乙氧基硅烷浓度在0.5％～2％mol/L；
[0011]步骤三、在步骤二中的二氧化硅层外表面修饰荧光物质：采用静电吸附的方式吸附在二氧化硅层表面，等离激元纳米颗粒@SiO2在剧烈搅拌状态下，逐滴滴加1％～5％质量分数的荧光物质，等离激元纳米颗粒@SiO2与荧光物质体积比在(10～50)：1，得到等离激元纳米颗粒@SiO2@荧光物质；
[0012]步骤四、于荧光物质外层包裹二氧化硅层，二氧化硅层厚度为3～10nm，得到等离激元纳米颗粒@SiO2@荧光物质@SiO2；
[0013]步骤五、在步骤四中的二氧化硅层上修饰相应的抗体：取带有羧基的抗体加入交联剂1
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(3
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二甲基氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺溶液中，混匀后，再加入N
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羟基琥珀酰亚胺溶液，混匀，活化15～30分钟；再加入带有氨基的等离激元纳米颗粒@SiO2@荧光物质@SiO2，避光偶联后，得到荧光探针。
[0014]在进一步的实施例中，所述步骤一中金属纳米颗粒为金纳米颗粒或银纳米颗粒。
[0015]在进一步的实施例中，所述步骤二中二氧化硅层厚度为3～10nm。
[0016]在进一步的实施例中，所述步骤三中荧光物质为：异硫氰酸荧光素FITC、四乙基罗丹明RIB200、四甲基异硫氰酸罗丹明TRITC、镧系螯合物、或量子点中的一种或几种的组合。
[0017]在进一步的实施例中，步骤一至步骤五的化学反应均在磁力搅拌器下完成，步骤二至步骤五中包覆或修饰后均需要采用低速多次离心进行清洗，去除未包覆或修饰的原料。
[0018]在另一个技术方案中，提供了一种多通道检测试剂盒，包括：
[0019]本体，其内至少设有进样腔，以及N个连通于所述进样腔的反应腔；
[0020]至少两组盖板，对应设于所述本体两侧；其中一个盖板上设有进样口，所述进样口连通于所述进液腔；
[0021]所述反应腔用于容纳检测试剂和样本液；所述检测试剂为上述制备方法制备得到的荧光探针。
[0022]在另一个技术方案中，提供了一种基于上述的一种多通道检测试剂盒的检测方法，所述方法包括以下步骤：
[0023]荧光探针以冻干形态装入反应腔内；将样本液从进样口加入流至进样腔内，并对应流入N个反应腔内；
[0024]将多通道检测试剂盒插入恒温检测仪中，对多通道检测试剂盒进行温浴；
[0025]反应腔内的荧光探针与样本液复溶；所述恒温检测仪通过光照实时检测反应腔中复溶液的透光性变化，并以模拟信号的形式进行输出；基于所述模拟信号绘制荧光光谱。
[0026]有益效果：
[0027](1)用荧光的差值作为生物标志物浓度的相关系数，解决了对绝对荧光强度的依赖，产品的批次差异减小；
[0028](2)实现了便携式均相免疫荧光检测，避免了层析方法易受环境干扰等弊端；
[0029](3)采用等离激元增强荧光，荧光强度相对初始荧光提升在100～10000倍的提升，检测精密度高；
[0030](4)检测试剂采用冻干形式封装在多通道检测试剂盒中，能够实现生物标志物的现场检测；
[0031](5)试剂盒的6个反应腔室决定一份样本可以检测1～6个生物标志物；
[0032](6)由于探测的是在本身荧光的基础上的增强荧光，样本中的背景荧光干扰相对就会很小，有利于产品应用于真实全血样本。
附图说明
[0033]图1是多通道检测试剂盒的结构示意图；
[0034]图2是荧光探针的结构图；
[0035]图3是无特异性生物标志物时荧光探针状态图；
[0036]图4是荧光探针与标志物耦合状态图；
[0037]图5是检测不同浓度肌钙蛋白Ⅰ的荧光光谱图。
[0038]图1至图5中各标注为：本体10、进样腔11、反应腔12、盖板20、进样口21、荧光探针30、等离激元纳米颗粒31、二氧化硅层32、荧光物质33、抗体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.荧光探针，其特征在于，所述探针为一球体结构，包括：等离激元纳米颗粒，包裹于所述等离激元纳米颗粒的二氧化硅层，以及按照预定需求分布在二氧化硅层外壁的抗体；所述二氧化硅层的预定位置处嵌入有荧光物质。2.根据权利要求1所述的荧光探针，其特征在于，相邻两组的荧光探针上的抗体通过抗原产生耦合作用。3.制备如权利要求1至2中任意一项所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、取粒径在40～100nm之间的金属纳米颗粒，对其进行氧化还原反应得到等离激元纳米颗粒内核；步骤二、于等离激元纳米颗粒内核外表面包裹二氧化硅层得到等离激元纳米颗粒@SiO2，二氧化硅层厚度为3～10nm；步骤三、在步骤二中的二氧化硅层外表面修饰荧光物质：将等离激元纳米颗粒@SiO2在搅拌状态下，逐滴滴加1％～5％质量分数的荧光物质，搅拌后得到等离激元纳米颗粒@SiO2@荧光物质；步骤四、于荧光物质外层包裹二氧化硅层，二氧化硅层厚度为3～10nm，得到等离激元纳米颗粒@SiO2@荧光物质@SiO2；步骤五、在步骤四中的二氧化硅层上修饰相应的抗体：将抗体加入交联剂1
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二甲基氨基丙基)
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乙基碳二亚胺溶液中，混匀后，再加入N
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羟基琥珀酰亚胺溶液，混匀，活化15～30分钟；再加入等离激元纳米颗粒@SiO2@荧光物质@SiO2，避光偶联后，得到荧光探针。4.如权利要求1所述的一种便携式多通道检测试剂盒，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶健，陆辉，汪涛，徐荣，
申请(专利权)人：南京诺尔曼生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：