检测MT-RNR1基因突变的引物、试剂盒和方法技术

本发明专利技术涉及检测MT

【技术实现步骤摘要】
检测MT
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RNR1基因突变的引物、试剂盒和方法


[0001]本专利技术涉及检测MT
‑
RNR1基因突变的引物、试剂盒和方法，属于生命科学和生物


技术介绍

[0002]氨基糖苷类抗生素的抗菌作用主要依靠结合细菌细胞内的细胞核糖核酸，破坏蛋白质的合成而导致细胞死亡。这类药物在使用后，会在内耳中的内外淋巴液中聚集，常可导致不可逆转的听觉和前庭系统的损伤。外毛细胞是最容易受损害的，听力高频部分最先下降；当剂量或使用时间增加，内毛细胞也受损伤，低频听力随之下降。在线粒体有遗传性缺陷的个体中，氨基糖苷类抗生素所致的耳聋发生率明显增高。
[0003]线粒体DNA(mtDNA)是独立于细胞核染色体外的基因组，具有自我复制，转录和编码功能，由16569个碱基对组成的环状双链DNA分子，外环为重链，内环为轻链，两条链均具有编码功能。每个mtDNA分子编码两类rRNA(12SrRNA和16SrRNA)，22种tRNA及13条与细胞氧化磷酸化有关的多肽链。MT
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RNR1即为mtDNA的12SrRNA，其基因全长953bp。mtDNA的遗传方式为母系遗传，mtDNA的基因排列紧密，没有内含子，而且各基因之间还可以有部分区域重叠，任何突变都会累及到基因组中的一个重要功能区域。由于mtDNA没有组蛋白的保护，并且其对损伤的修复能力不足，所以mtDNA的突变率较核DNA高10倍左右。mtDNA上的突变具有重要的临床意义，在带有线粒体12SrRNA突变的患者中，线粒体rRNA在结构上与细菌的核糖体更为相似，增加了氨基糖苷类抗生素与该rRNA结合的危险，从而使应用此类药物后毛细胞的耳毒性作用更为明显。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于解决上述技术问题而提供一种用于检测MT
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RNR1基因突变的引物。
[0005]本专利技术解决上述问题的技术方案如下：
[0006]一种用于检测MT
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RNR1基因突变的引物，所述引物包括用于扩增MT
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RNR1基因m.1494和m.1555位点的扩增引物rCRS
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F、rCRS
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R和测序引物M13F、M13R，rCRS
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F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCAGAAAACTACGATAGCCCTT
[0007]rCRS
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R:AACAGCTATGACCATGCATCTTTCCCTTGCGGTACTA
[0008]M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
[0009]M13R：AACAGCTATGACCATG。
[0010]MT
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RNR1基因中的m.1494C>T和m.1555A>G是PharmGKB中收录的证据等级为1A的氨基糖苷类等药物毒副作用风险增加的位点。本专利技术针对上述两个位点所设计的引物方法可以有效判断该位点的突变情况，从而指导用药，帮助避免新生儿在成长道路上因抗生素使用不当而导致的耳聋，进一步的，因聋致哑的情况发生。
[0011]本专利技术的第二个目的是提供一种试剂盒。
[0012]一种用于检测MT
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RNR1基因突变的试剂盒，所述试剂盒包含如上所述的引物、检测体系PCR扩增反应液、测序体系反应液。
[0013]作为上述技术方案的优选，所述检测体系PCR扩增反应液包括2
×
PCR Buffer、dNTPs和KOD FX DNA聚合酶。
[0014]进一步地，所述测序体系反应液包括EDTA、无水乙醇、75％乙醇、HIDI和Bigdye Terminator V3.1。
[0015]进一步地，所述测序体系反应液还包括测序纯化液，所述测序纯化液包括核酸外切酶I和牛小肠碱性磷酸酶。
[0016]进一步地，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品。
[0017]本专利技术的第三个目的是提供上述试剂盒的使用方法，用于检测MT
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RNR1基因m.1494和m.1555位点突变情况。
[0018]一种用于检测MT
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RNR1基因突变的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
[0019]1)抽提外周血或肌肉组织中的基因组DNA；
[0020]2)利用扩增引物rCRS
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F、rCRS
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R对步骤1)中提取的DNA进行扩增，获得扩增产物；
[0021]rCRS
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F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCAGAAAACTACGATAGCCCTT
[0022]rCRS
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R:AACAGCTATGACCATGCATCTTTCCCTTGCGGTACTA；
[0023]3)利用测序引物M13F、M13R对步骤2)中的扩增产物进行测序；
[0024]M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
[0025]M13R：AACAGCTATGACCATG；
[0026]4)对测序结果进行判断，通过判读MT
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RNR1基因m.1494和m.1555位点的测序图中是否有双峰来判断MT
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RNR1基因是否发生突变。
[0027]综上所述，本专利技术具有以下有益效果：
[0028]本专利技术设计了扩增MT
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RNR1基因m.1494和m.1555位点的引物，采用PCR技术，构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳；另外两个目标位点可以使用一对引物扩增，节省了工作时间和人工成本；总之本专利技术所述的引物、方法可以极大地降低样本和试剂使用量，从而显著地降低检测成本；相比较于PCR
‑
RFLP法，本方法具有省时省力的优点，相比较于荧光定量PCR法则降低了检测的成本和难度。
附图说明
[0029]图1为样品1的检测结果图；
[0030]图2为样品2的检测结果图。
具体实施方式
[0031]下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本专利技术。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
[0032]实施例1
[0033]检测MT
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RNR1基因m.1494和m.1555位点突变情况的引物，该引物是特异性针对MT
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RNR1基因m.1494和m.1555位点所设计的扩增引物：
[0034]检测MT
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RNR1基因m.1494和m.1555位点突变情况的试剂盒，包括
[0035](i)血液/组织DNA抽提试剂；
[0036](ii)检测体系PCR反应本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测MT
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RNR1基因突变的引物，所述引物包括用于扩增MT
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RNR1基因m.1494和m.1555位点的扩增引物rCRS
‑
F、rCRS
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R和测序引物M13F、M13R，rCRS
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F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCAGAAAACTACGATAGCCCTTrCRS
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R:AACAGCTATGACCATGCATCTTTCCCTTGCGGTACTAM13F：TGTAAAACGACGGCCAGTM13R：AACAGCTATGACCATG。2.一种用于检测MT
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RNR1基因突变的试剂盒，所述试剂盒包含如权利要求1所述的引物、检测体系PCR扩增反应液、测序体系反应液。3.根据权利要求2所述的一种用于检测MT
‑
RNR1基因突变的试剂盒，其特征在于：所述检测体系PCR扩增反应液包括2
×
PCR Buffer、dNTPs和KOD FX DNA聚合酶。4.根据权利要求2所述的一种用于检测MT
‑
RNR1基因突变的试剂盒，其特征在于：所述测序体系反应液包括EDTA、无水乙醇、75％乙醇、HIDI和Bigdye Terminator V3.1。...

【专利技术属性】
技术研发人员：林筱剑，
申请(专利权)人：上海锦测医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：