本发明专利技术属于生物化学和酶工程技术领域，具体涉及一种深海来源的PET水解酶及其应用。一种深海来源的PET水解酶dsPETase06，其氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。本发明专利技术还提供了编码所述PET水解酶dsPETase06的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明专利技术提供一种来自深海的宏基因组中挖掘并鉴定的PET水解酶dsPETase06，该酶能够在高盐或高温的环境下展现出对PET的高水解活性，在环保、催化领域都有重要意义。重要意义。重要意义。
【技术实现步骤摘要】
一种深海来源的PET水解酶dsPETase06及其应用
[0001]本专利技术属于生物化学和酶工程
，具体涉及一种深海来源的PET水解酶及其应用。
技术介绍
[0002]塑料因其耐久性、延展性、可塑性、稳定性、透光性等优良属性已遍布人类生产生活的各个方面。而塑料在常温下的化学惰性使得大量的塑料废弃物造成的白色污染日益严重，危害生态环境与人类健康。PET是一类由对苯二甲酸和乙二醇为单体聚合而成的聚酯类塑料，在纺织产业、食品饮料包装等多个领域有着广泛应用。传统的PET处理手段如机械破碎、热塑再加工以及化学分解等方法成本昂贵，且会造成环境的二次污染。近年来，基于PET水解酶的生物酶法降解展现出巨大的应用潜力，如来自PET降解菌Ideonella sakaiensis 201
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F6中的IsPETase(Yoshida et al.,2016)，以及来自于枝叶堆肥的宏基因组的LCC(Sulaiman et al.,2012)，均有着很好的PET水解活性，而利用它们的突变体进行PET水解、单体回收以及PET再合成，已展现出PET的循环经济在理论上的可行性(Lu etal.,2022；Tournier et al.,2020)。
[0003]PET水解酶的嗜盐性研究较少，来自嗜盐菌产期弧菌(Vibrio gazogenes)中的PET6被证明可耐受0～2.5M的NaCl，但其活性远远低于IsPETase(Weigert etal.,2022)，因此，高盐条件下能够表现出高PET水解活性的酶目前是一个空白。
技术实现思路
[0004]本专利技术的目的是解决现有的高PET水解活性的酶不能耐受高盐环境的问题，提供一种来自于马里亚纳海沟10400米的宏基因组中挖掘并鉴定的PET水解酶dsPETase06，该酶能够在高盐或高温的环境下展现出对PET的高水解活性。
[0005]本专利技术解决其技术问题采用的技术方案是：一种深海来源的PET水解酶dsPETase06，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0006]优选地，本专利技术还提供了编码所述PET水解酶dsPETase06的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0007]优选地，本专利技术还提供了所述PET水解酶dsPETase06的载体，所述载体中包含所述的基因。
[0008]优选地，所述的载体为真核载体或者原核载体。
[0009]优选地，所述的载体为质粒载体或者病毒载体。
[0010]优选地，本专利技术还提供了包含所述的载体的宿主细胞。
[0011]优选地，所述的宿主细胞为细菌。
[0012]优选地，本专利技术还进一步提供了所述的PET水解酶dsPETase06、所述的载体、所述的宿主细胞在高盐或高温条件下降解PET中的应用。
[0013]优选地，本专利技术还进一步提供了PET降解剂，该PET降解剂含有所述的PET水解酶
dsPETase06、所述的表载体、所述的宿主细胞中的至少一种。
[0014]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术提供的PET水解酶dsPETase06能够在高盐或高温的环境下催化PET的水解反应，生成MHET和TPA，后续可以通过回收MHET和TPA重新聚合生成新的PET使其达到循环的目的；同时，该酶嗜盐的特性使其更好的适用于高盐的工业废水、污水处理，因此本专利技术在环保、催化领域都有着重要意义。
附图说明
[0015]图1为dsPETase06在不同NaCl浓度下催化PET水解；
[0016]图2为表达dsPETase06的pDSP06质粒图谱；
[0017]图3为纯化后的dsPETase06的SDS
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PAGE分析；M,蛋白marker；1.纯化后的dsPETase06；
[0018]图4为dsPETase06在不同盐浓度下催化PET水解48小时的产物浓度；HPLC可检测到的水解产物为TPA与MHET，以反应液中TPA与MHET的浓度之和表现PET水解活性的大小；
[0019]图5为dsPETase06在不同盐浓度下催化PET水解120小时的产物浓度；HPLC可检测到的水解产物为TPA与MHET，以反应液中TPA与MHET的浓度之和表现PET水解活性的大小；
[0020]图6为dsPETase06催化scPET膜的完全降解；试管中反应体系为3mL，scPET为3mg，反应时间见左侧箭头标注，酶浓度标注于酶名称的下方；
[0021]图7为dsPETase06在不同温度下催化PET水解48小时的产物浓度；HPLC可检测到的水解产物为TPA与MHET，以反应液中TPA与MHET的浓度之和表现PET水解活性的大小；
[0022]图8为dsPETase06在不同温度下催化PET水解120小时的产物浓度HPLC可检测到的水解产物为TPA与MHET，以反应液中TPA与MHET的浓度之和表现PET水解活性的大小。
具体实施方式
[0023]为了便于理解本研究，下面结合附图和具体实施例，对本研究进行更详细的说明。但是，本研究可以以许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本研究公开内容的理解更加透彻全面。
[0024]本专利技术从深海宏基因组中间进行筛选，筛选得到一个酶，将其命名为dsPETase06。以下通过实验对该酶进行功能特性及催化活性的测试和验证。
[0025]1.dsPETase06的底物的制备
[0026]作为验证DsPETase06功能的PET我们购买了GfPET(ES301445,Goodfellow,Huntingdon,England)，通过打孔器将制备成直径6mm的PET膜作为反应的底物。
[0027]scPET膜的制备：通过溶剂溶解—挥发的方式自制scPET膜来检测PET水解活性的报道见参考文献(Liu et al.,2023；Cui et al.,2021)。本实例中所制备的scPET膜方法为：将2mL 1,1,1,3,3,3
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六氟
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丙醇(HFIP)溶解的GfPET(40mg/mL)均匀涂膜在直径为10cm的平板玻璃板上，在室温下过夜蒸发HFIP，在75％乙醇中孵育2小时，将所得scPET膜从玻璃板上剥离。
[0028]2.dsPETase06基因与蛋白序列分析
[0029]为了确定DsPETase06氨基酸序列的新颖性，我们通过在线BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在GenBank中搜索它的同源蛋白并按序列相似性排
列，如表1所列的为GeneBank数据库中与dsPETase06一致性最高的30个序列，其中与DsPETase06进化上最相近的蛋白的一致性为86.76％，说明该蛋白(SEQ ID No.1)的全长序列尚未公开披露过，具有新颖性。...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种深海来源的PET水解酶dsPETase06，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。2.编码如权利要求1所述的PET水解酶dsPETase06的基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。3.包含如权利要求2所述的基因的载体。4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于：所述的载体为真核载体或者原核载体。5.根据权利要求3所述的载体，其特征在于：所述的载体为质粒载体或者病毒载体。6.包含如权利要求3
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5任一项所述的载体的宿主细胞。7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征...
【专利技术属性】
技术研发人员：孟亮，李盛英，李登辉，刘琨，陆瑞，张成松，姬倩悦，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：
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