蝰属磷脂酶A2特征多肽及其应用制造技术

本发明专利技术涉及化学分析定性检测技术领域，尤其涉及一种蝰属磷脂酶A2特征多肽及其应用。所述特征多肽氨基酸序列为LVEYSYSYR。该特征多肽可用于检测待测样品中特征多肽种属来源，检测准确度高，可以显著提高蛇毒血凝酶注射液的质量控制水平，确保产品临床用药的有效性和安全性。本发明专利技术所述特征多肽能够对样品中磷脂酶A2进行有效鉴别，一方面填补了蝰属磷脂酶A2种属鉴别的空白，另一方面也为磷脂酶A2更多药理学活性和临床应用的开发提供了保障。学活性和临床应用的开发提供了保障。学活性和临床应用的开发提供了保障。

【技术实现步骤摘要】
蝰属磷脂酶A2特征多肽及其应用


[0001]本专利技术涉及化学分析定性检测
，尤其涉及蝰属磷脂酶A2特征多肽及其应用。

技术介绍

[0002]磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2） 几乎存在于所有蛇毒液中，是生物体膜上一种重要的含钙金属酶,能特异性地水解sn
‑3‑
磷酸甘油酯2位上酯酰键生成游离的脂肪酸和溶血磷脂，广泛参与多种生物进程如磷脂代谢、免疫防御和信号传导，因而成为研究脂肪酸代谢、磷脂膜结构、磷脂与膜蛋白相互作用以及膜蛋白结构与功能的重要工具酶。圆斑蝰（Daboia russelii siamensis），是蛇亚目蝰科蝰亚科蝰属下的一种有毒蝰蛇。研究表明圆斑蝰脂酶A2具有神经毒性、间接溶血，强肌坏死活性和细胞毒性。不同种属来源磷脂酶A2氨基酸序列存在差异，导致作用位点不同，表现出不一样的药理活性。目前市场中蛇毒血凝酶注射液的有效成分是从蝰蛇科蛇毒中提取的蛇毒血凝酶，可用于各种出血疾病。磷脂酶A2作为潜在的杂质，对制剂中磷脂酶控制对于提高药品质量，保证临床用药安全十分重要。目前磷脂酶A2检测多采用卵磷脂降解法检测磷脂酶活性，该方法操作复杂，灵敏度较低。因此开发一种简便快捷、具有鉴别的作用的方法对蝰属圆斑蝰蛇磷脂酶A2研究及蛇毒血凝酶注射液的质量控制十分重要。
[0003]液质联用技术拥有高灵敏度、高分辨率、高稳定性、高特异性和高效分离等特点，广泛应用于样品的定性定量分析之中。对于蛋白类样品的种属鉴别，重要是特征肽的筛选、前处理及质谱条件的优化，特征肽需要同时具有种属特异性、稳定性、质谱响应高等，后续针对该特征肽进行相应的前处理及液质条件优化。

技术实现思路

[0004]为解决上述技术问题，本专利技术的专利技术目的是提供蝰属磷脂酶A2特征多肽，所述特征多肽能够对样品中磷脂酶A2进行有效鉴别，填补了蝰属磷脂酶A2种属鉴别的空白。
[0005]为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：蝰属磷脂酶A2特征多肽，所述特征多肽氨基酸序列为LVEYSYSYR。
[0006]一种上述蝰属磷脂酶A2特征多肽的应用，所述特征多肽可用于鉴别磷脂酶A2的种属来源。
[0007]进一步地，上述鉴别方法采用以下步骤：（1）取待测样品溶解，进行酶解灭活后作为待测样品溶液；（2）水经过酶解处理，制备空白溶液；（3）取步骤（1）所制备的待测样品溶液及步骤（2）所制备的空白溶液注入液相色谱
‑
质谱仪，采用电喷雾正离子模式，进行多反应监测，以质荷比m/z 590.29
→
675.31及590.29
→
838.37作为特征多肽的检测离子对，以确定待测样品中是否含有蝰属磷脂酶A2特征多肽中的特征多肽；
（4）如果检测到上述特征多肽,则证明待测样品中含有磷脂酶A2且来源于蝰属；反之若则证明待测样品中不含有来源于蝰的磷脂酶A2。
[0008]进一步地，步骤（3）所述液相色谱
‑
质谱仪中液相和质谱检测条件中，液相条件为：Waters ACQUITY UPLC BEH C
18 色谱柱（50 mm*2.1 mm，1.7 μm）；流动相A：0.1%甲酸溶液流动相，B：0.1%甲酸乙腈；柱温：40℃；进样量：5 μL；流速：0.3 ml/min；按下表进行梯度洗脱：。
[0009]进一步地，步骤（1）制备待测样品的具体操作为：
①
待测样品溶解：待测样品用1%碳酸氢铵配制为浓度1
ꢀµ
g/
µ
L；
②
酶解：取步骤
①
溶解后样品100
ꢀµ
L，加2
ꢀµ
g蛋白酶于37℃过夜酶解，酶解结束后高温灭活；
③
离心：最后取步骤
②
酶解灭活的样品，12000 rpm离心10 min，取上清液即得待测样品。
[0010]优选地，所述的蛋白酶为胰蛋白酶。
[0011]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：由于已知白眉蝮蛇、矛头蝮蛇、尖吻蝮蛇等蛇毒的磷脂酶A2氨基酸序列中不含有本专利技术所述的特征多肽，因此，该特征多肽可用于检测待测样品中磷脂酶A2特征多肽的种属来源，检测准灵敏度高，一方面填补了蛇毒血凝酶注射液质量标准的空白，可以显著提高其质量控制水平，确保产品临床用药的有效性和安全性；另一方面也为蝰属磷脂酶A2更多药理学活性和临床应用的开发提供了保障。
附图说明
[0012]构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。以下，结合附图来详细说明本专利技术的实施方案，其中：图1为实施例1中蝰属磷脂酶A2特征多肽 LVEYSYSYR二级质谱图；图2为实施例2中空白溶液特征多肽提取离子色谱图；图3为实施例2中矛头蝮蛇蛇毒特征多肽提取离子色谱图；图4为实施例2中圆斑蝰蛇蛇毒特征多肽提取离子色谱图。
具体实施方式
[0013]在接下来的描述中进一步阐述了本专利技术的具体细节用于充分理解本专利技术。本专利技术中的说明书所使用的术语只是为了用于说明本专利技术的优点和特点，不是旨在于限制本发
明。
[0014]除非另行定义，本专利技术中所使用的所有专业与科学术语属于本专利技术的
的技术人员所理解的含义相同。如无特殊说明，本专利技术所使用的药品或试剂均按照产品说明书使用或采用所属领域的常规使用方法。现根据说明书附图和具体实施方式对本专利技术的技术方案作进一步说明。
[0015]实施例1 蝰属磷脂酶A2特征多肽的筛选和确定（1）试剂耗材试剂：甲酸、乙腈、碘代乙酰胺、胰蛋白酶（sigma）、盐酸胍（VETEC）、二硫苏糖醇（BBI Life Sciences），其它试剂均为分析纯。
[0016]仪器：超纯水仪（Milli_Q）、电子天平（METTLERTOLEDO）、冷冻干燥机（LABCONC）、离心浓缩仪（LABCONC）、高分辨质谱（Thermo Scientific，QEplus）、纳升液相系统（Thermo Scientific, EASY
‑
nLC 1000）。
[0017]（2）样品处理样品溶解：圆斑蝰蛇粗毒取适量配置成1
ꢀµ
g/
µ
L；还原烷基化：取50
ꢀµ
L（1
ꢀµ
g/
µ
L）样品溶液，加入80
µ
L变性缓冲液（称0.606 g Tris，8.04 mg EDTA，5.73 g盐酸胍，加水10 mL溶解，用HCl调pH至 8.1）及20
ꢀµ
L 1 M DTT，60℃反应30min；加入40
ꢀµ
L 1 M IA，避光反应30 min；脱盐：10k超滤膜水洗一次后，加入还原烷基化样品，12000 rpm离心，加400
µ
L12000 rpm离心，重复3次。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.蝰属磷脂酶A2特征多肽，其特征在于，所述特征多肽氨基酸序列为LVEYSYSYR。2.一种权利要求1所述蝰属磷脂酶A2特征多肽的应用，特征在于，所述特征多肽可用于鉴别磷脂酶A2的种属来源。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，鉴别采用以下步骤：（1）取待测样品溶解，进行酶解灭活后作为待测品溶液；（2）水经过酶解处理，制备空白溶液；（3）取步骤（1）所制备的待测品溶液及步骤（2）所制备的空白溶液注入液相色谱
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质谱仪，采用电喷雾正离子模式，进行多反应监测，以质荷比m/z 590.29
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675.31及590.29
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838.37作为特征多肽的检测离子对，以确定待测样品中是否含有蝰属磷脂酶A2特征多肽中的特征多肽；（4）如果检测到权利要求1所述的特征多肽,则证明待测样品中含有磷脂酶A2且来源于蝰属；反之则证明待测样品中不含有来源于蝰属A2的磷脂酶A2。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（3）所述液相色谱
‑
质谱仪中液相和质谱...

【专利技术属性】
技术研发人员：张冬梅，王聪聪，贺美莲，程春雷，杭宝建，咸瑞卿，石峰，巩丽萍，
申请(专利权)人：山东省食品药品检验研究院，
类型：发明
国别省市：