一种评价小麦穗部组织对DON毒素运输能力的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种评价小麦穗部组织对DON毒素运输能力的方法及其应用。本发明专利技术主要对接种赤霉菌的小麦穗部不同部位的DON毒素含量绝对值进行检测并计算出小麦穗部组织对DON毒素的运输能力。利用该表型评价方法，结合全基因组关联分析，发明专利技术人鉴定出一个显著与DON毒素运输力关联的位点，位于1A染色体463,808,261bp

【技术实现步骤摘要】
个/mL，每个小穗接种10μL。
[0011]其中，步骤3)中侵染区小穗的毒素含量的检测方法包括：取侵染区多个独立麦穗的穗部组织混合作为一个样本，磨粉，随后通过液质联用的方法检测毒素得到DON
IS
。
[0012]其中，步骤3)非取侵染区多个独立麦穗的穗部组织混合作为一个样本，磨粉，随后通过液质联用的方法检测毒素得DON
US
。
[0013]本
技术实现思路
还包括所述的方法在基因定位或在筛选低毒素或低运输能力的小麦品种中的应用。
[0014]其中，所述低毒素小麦品种为DTC≤0.2的小麦品种。
[0015]其中，所述低毒素或低运输能力的小麦品种包括新冬20、石麦19、青春5号、济宁13、开麦21、科遗26。
[0016]本
技术实现思路
还包括一种低毒素小麦品种或低运输能力的小麦品种的筛选方法，包括以下步骤：利用所述的方法筛选DTC≤0.2的小麦品种。
[0017]有益效果：本专利技术首次获得了一种有效、稳定性好的分析评价小麦穗部组织DON毒素运输能力的方法，可以进行低DTC小麦种质的筛选和创制以及DTC相关基因的定位和克隆，对于保证粮食的品质安全具有重要意义和应用前景。
附图说明
[0018]图1、赤霉病接种后分穗采样及DON检测流程图。A：双花滴注方法接种禾谷镰刀菌。注射器所指第六小穗为接种的小穗，蓝色小点代表接种的小花。B：接种成功的穗子在成熟期的表型。根据禾谷镰刀菌侵染的程度分为三个部分，上部是被禾谷镰刀菌完全侵染的小穗(IS)，无籽粒形成或者形成干瘪的籽粒；中部为由上部禾谷镰刀菌向下扩展造成侵染的部分，小穗的颖壳呈现出赤霉病经典的漂白状；下部为非侵染区(US)，无赤霉病症状，但籽粒饱满。C：收集三个独立穗子的IS区混合后磨粉后利用液质联用的方法检测该区域的毒素含量。D：收集三个独立穗子的US区混合后磨粉后利用液质联用的方法检测该区域的毒素含量。
[0019]图2、XP和XSB群体病穗数分布频率直方图。
[0020]图3、通过分穗法检测XP和XSB群体的DTC直方图。
[0021]图4、通过分穗法分析XP和XSB群体DTC的基因定位结果。
[0022]图5、DON标准曲线。
具体实施方式
[0023]以下结合实例对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实施例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。
[0024]利用小麦自然群体对小麦DTC进行全基因组关联分析(GWAS)，获得与DTC紧密连锁的QTL位点，具体实施方法如下：
[0025]1、材料的选择
[0026]为了评价该方法的有效性，我们选择两个由不同小麦品种组成的群体进行检测，分别命名为XP群体和XSB群体，群体的整体抗性不同，XP群体多数为抗病品种，以国内品种居多，长江中下游品种占到60％；XSB群体赤霉病抗性以中感居多，抗性服从正态分布，来源
世界多个地区，具有广泛的代表性。XP群体和XSB群体的品种数目分别是125和130，群体品种详见表1和表2。其中XP群体的平均病穗数约为6.5，XSB的平均病穗数约为9.5，相比较而言，XP群体中大部分品种对赤霉病比较抗，由图2A可以看出，该群体将近40％的品种属于高抗品种。而XSB群体的赤霉病抗性呈现正态分布，中感材料居多(图2B)。
[0027]表1.XP群体的品种和来源
[0028][0029][0030][0031]XP群体样本的选取涵盖了包括美国、韩国、日本以及中国在内的四个国家，其中以中国江苏的品种占比最高。
[0032]表2.xsB群体的品种和来源
[0033][0034][0035]XSB群体的样本选取涉及了14个地区，其中以美国、中国的品种占比居多，在我国又以山东省的品种选取最多。
[0036]2、对两个群体的材料进行基因型分析。
[0037]利用小麦55K SNP芯片对XP进行基因型分析，通过转录组测序的方法对XSB群体进行基因型分析。
[0038]2.1、XP群体材料DNA的提取
[0039](1)以上每个品种的小麦叶片分别取3cm左右，放入2mL离心管；
[0040](2)加入1粒磨样钢珠，盖紧盖子，将其放入液氮中60s，然后利用采用磨样机磨样30s，磨样频率1400r/min；
[0041](3)在磨好的样中加入1.5％的CTAB提取液1000μl，放入70℃烘箱中，静置1h，每隔20min颠倒混合一次；
[0042](4)冷却至室温加入500μL的氯仿，上下颠倒混匀，配平离心12000r/min，5min；
[0043](5)吸取上清液600μL加入新的1.5ml的离心管，加等量异丙醇，上下颠倒混匀10次，
‑
20℃，1h静置；12000r/min离心5min，去上清；
[0044](6)加入1mL的75％酒精清洗；
[0045](7)配平离心12000r/min，5min，弃酒精，吸取多余液体，室温吹干；
[0046](8)加入50μL的ddH2O，室温溶解30min，
‑
20℃保存备用或者送北京中玉金标记(北京)生物技术股份有限公司公司做芯片分析。
[0047]2.2、XSB群体材料RNA的提取
[0048]研钵经180℃高温处理8h或经燃烧处理以消除RNA酶污染；氯仿、异丙醇，乙醇等试剂使用新开封未被污染的；其它器材如枪头、离心管和试剂如超纯水、NaAc，均经1
‰
DEPC水处理过夜后121℃高温湿热灭菌30min，枪头，离心管65℃烘干备用；采用Trizol法提取XSB群体各个小麦品种的mRNA：
[0049](1)取约100mg小麦叶片用液氮研磨材料，加入1mL RNAiso Plus试剂(Takara，Code No.：9109)，充分匀浆后，将匀浆液吸入1.5mL离心管，室温放置5min；
[0050](2)加入200μl氯仿，震荡混匀，静置5min，4℃，12000r/min，离心10min；
[0051](3)取上清于另一离心管，加等体积异丙醇，振荡混匀，
‑
20℃沉淀30min，4℃，12000r/min，离心10min；
[0052](4)弃上清，用1mL 75％的乙醇(DEPC处理过的无菌水配制)洗涤，4℃，12000r/min，离心10min，室温风干10min左右，加40μL DEPC处理过的RNase Free水(DEPC水)溶解沉淀，
‑
80℃保存备用或者直接送华大基因公司做转录组测序，分析品种的SNP信息。
[0053]3、表型鉴定。
[0054]3.1禾谷镰刀菌孢子液的制备
[0055]本实验所用的菌株为已经测序的禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)菌种PH
‑
1，用时接种于PDA培养基并置于25℃培养箱培养5天，后在长好的菌板上打孔置于绿本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种评价小麦穗部组织对DON毒素运输能力的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）在小麦穗部扬花期，对麦穗由上向下第1
‑
6个小穗任意一个小穗的两个小花接种禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）的孢子液；2）根据发病的严重程度，将穗子分为侵染区小穗、过渡区穗子和非侵染区小穗；侵染区小穗表现为干枯，无饱满种子形成，穗轴出现褐化现象；过渡区穗子种子灌浆饱满，颍壳发白，穗轴无褐化现象；非侵染区与正常穗子无异，籽粒灌浆饱满；3）将检测的侵染区小穗的毒素含量命名为DON
IS
，将非侵染区小穗的毒素含量命名为DON
US
，建立毒素运输能力计算公式为：DON Transportation Capacity（DTC）=；4）当DTC≦0.2，则认为所述小麦品种具有低DON运输能力；当DTC≧0.7，则认为所述小麦品种具有高DON运输能力。2.根据权利1所述评价小麦穗部组织对DON毒素运输能力的方法，其特征在于，步骤1）所述禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）的孢子液浓度为1
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105个/mL，每个小穗接种10μL。3.根据权利1所述评价小麦...

【专利技术属性】
技术研发人员：‑，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：