微量蛋白质样本的蛋白组分析方法技术

本申请涉及一种微量蛋白质样本的蛋白组分析方法。该微量蛋白质样本的蛋白组分析方法包括如下步骤：在数据依赖模式的无动态排除功能下对微量蛋白质样本进行质谱分析，并采集同一肽段不同价态的一级质谱母离子的各二级质谱，所述质谱分析中，二级质谱累积时间为30ms～60ms，二级质谱扫描次数为50次～100次，二级谱扫描的母离子强度阈值为10cps～30cps。该微量蛋白质样本的质谱数据的采集方法可以对同一肽段相同和不同价态的母离子多次碎裂和扫描，提高了微量蛋白质样本的蛋白质和肽段的鉴定数目。且避免了由于扫描的随机性和不重现性而影响定量准确度和重现性，提高多重定量标记样本的谱图纯度和定量准确度。样本的谱图纯度和定量准确度。样本的谱图纯度和定量准确度。

【技术实现步骤摘要】
微量蛋白质样本的蛋白组分析方法


[0001]本申请涉及蛋白组学
，特别是涉及一种微量蛋白质样本的蛋白组分析方法。

技术介绍

[0002]蛋白质组多重定量方法能实现一次进样同时对多组样品进行相对定量分析，从而提高蛋白质组的分析通量。目前，最具代表性也是使用最广泛的两种蛋白质组多重定量标记方法为Tandem Mass Tag(TMT)及Isobaric tags for relative and absolute quantitation(iTRAQ)技术。TMT及iTRAQ多重标记试剂均是由报告基团、平衡基团及反应基团组成，通过报告基团及平衡基团上同位素的组合，可以实现多组样品在标记后，来自不同样品的同一条肽段在一级谱图上质荷比相同，而在二级谱上会出现对应不同样品的报告离子，通过比较报告离子的强度，从而获取对应肽段在不同样品中的相对定量信息。目前，iTRAQ试剂可以实现至多对8组样品的同时定量分析，TMT试剂可实现至多对18组样品的同时定量分析，显著提高了分析通量，降低了单个样品的分析成本。
[0003]TMT及iTRAQ虽有效地提高了分析通量，但由于在质谱分析时样品极其复杂，肽段在分离和碎裂时极易受到共洗脱和共碎裂干扰肽段离子的影响，即在同一色谱洗脱时间内，除了目标肽段，还有其他干扰离子同时被洗脱下来进行质谱扫描；而在质谱扫描时，扫描窗口内除了目标肽段离子，还有其他质荷比极其相近的其他干扰离子，由于这些离子在经TMT或iTRAQ标记后报告离子峰相同，从而会影响目标肽段离子的定量。目前的质谱非靶向采集模式主要有数据依赖模式(Data Dependent Acquisition，DDA)和数据非依赖模式(Data Independent Acquisition，DIA)两种，对TMT或者iTRAQ标记样本的分析几乎均采用DDA模式，这是因为DIA模式下，不同肽段会进入同一个碎裂窗口，而不同肽段的报告离子相同，这就导致不同肽段在不同样品里的定量信息都堆叠在一起，导致无法获得每一个肽段在不同样品里的相对定量信息。在DDA模式下，尽管目前有多种技术来降低共洗脱和共碎裂干扰离子的影响，提高谱图纯度，但由于传统质谱采集模式对同一肽段的二级谱扫描次数有限，且不会扫描同一肽段不同价态的一级谱母离子，导致蛋白质鉴定数目的降低，如何在提高谱图纯度和定量精度的同时不影响蛋白质的鉴定深度是亟需解决的问题。

技术实现思路

[0004]基于此，本申请提供了一种蛋白质和肽段鉴定数目较高的情况下，多重标记样本谱图纯度较好，且定量准确度较高的微量蛋白质样本的蛋白组分析方法。
[0005]具体技术方案如下：
[0006]本申请一方面提供了一种微量蛋白质样本的蛋白组分析方法，包括如下步骤：
[0007]在数据依赖模式的无动态排除功能下对微量蛋白质样本进行质谱分析，以采集同一肽段不同价态的一级质谱母离子的二级质谱，所述质谱分析中，二级质谱累积时间为30ms～60ms，二级质谱扫描次数为50次～100次，二级谱扫描的母离子强度阈值为10cps～
30cps。
[0008]在其中一个实施例中，所述蛋白质样本为无标记蛋白质样本；在进行所述质谱分析之前，还包括对所述蛋白质样本进行预处理，所述预处理包括步骤：
[0009]将样本采用溶剂进行溶解处理，得到无标记蛋白质样本；及将所述无标记蛋白质样本进行肽段分级，得到预处理后样本。
[0010]在其中一个实施例中，所述肽段分级为高pH反相分级或质谱气相分级。
[0011]在其中一个实施例中，所述质谱气相分级分8级后进行色谱分离
‑
质谱分析，第一次质谱气相分级的扫描范围为400m/z～500m/z，第二次质谱气相分级的扫描范围为500m/z～600m/z，第三次质谱气相分级的扫描范围为600m/z～700m/z，第四次质谱气相分级的扫描范围为700m/z～800m/z，第五次质谱气相分级的扫描范围为800m/z～900m/z，第六次质谱气相分级的扫描范围为900m/z～1000m/z，第七次质谱气相分级的扫描范围为1000m/z～1100m/z，第八次质谱气相分级的扫描范围为1100m/z～1200m/z。
[0012]在其中一个实施例中，所述溶剂包括水、乙腈、甲酸和三氟乙酸中的至少一种。
[0013]在其中一个实施例中，所述蛋白质样本为多重定量标记蛋白质样本；在进行所述质谱分析之前，还包括对所述蛋白质样本进行肽段除盐的步骤。
[0014]在其中一个实施例中，所述多重定量标记蛋白质样本为iTRAQ或TMT标记的蛋白质样本。
[0015]在其中一个实施例中，所述样本包括微量细胞样本、组织样本或体液样本中的至少一种。
[0016]在其中一个实施例中，所述样本的蛋白量为10ng～200ng。
[0017]在其中一个实施例中，所述肽段包括氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的肽段。
[0018]上述微量蛋白质样本的蛋白组分析方法包括在数据依赖模式的无动态排除功能下对微量蛋白质样本进行质谱分析，可以对同一肽段母离子多次碎裂和扫描，同时，对于同一肽段不同价态的一级质谱母离子，均采集其二级质谱，二级质谱累积时间为30ms～60ms，二级质谱扫描次数为50次～100次，二级谱扫描的母离子强度阈值为10cps～30cps，上述方法避免了由于扫描的随机性和不重现性，提高了谱图纯度和定量准确度；且实现了对同一肽段不同形式尽可能多的扫描，提高了蛋白质、肽段的鉴定数目。
附图说明
[0019]图1为实施例1和对比例1中100ng和10ng蛋白质样本蛋白质、肽段、谱图的鉴定结果图；
[0020]图2为实施例1和对比例1中蛋白质样本的质谱数据采集的谱图对比图；
[0021]图3为实施例2和对比例2中200ng和25ng蛋白质样本经高pH反相分级后蛋白质、肽段和谱图的鉴定结果图；
[0022]图4为实施例3和对比例3中200ng蛋白质样本经质谱气相分级后蛋白质、肽段和谱图的鉴定结果图；
[0023]图5为实施例4和对比例4中蛋白质样本谱图纯度及相应鉴定数目图；
[0024]图6为实施例4和对比例4中蛋白质样本定量准确度图；
[0025]图7为实施例5、对比例5、对比例6及对比例7中采集的谱图对比图。
具体实施方式
[0026]为使本申请的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本申请的具体实施方式做详细的说明，并给出了本申请的较佳实施例。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本申请。但是本申请能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下做类似改进，因此本申请不受下面公开的具体实施例的限制。
[0027]除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的
的技术人员通常理解的含义相同。在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种微量蛋白质样本的蛋白组分析方法，其特征在于，包括如下步骤：在数据依赖模式的无动态排除功能下对微量蛋白质样本进行质谱分析，并采集同一肽段不同价态的一级质谱母离子的各二级质谱，所述质谱分析中，二级质谱累积时间为30ms～60ms，二级质谱扫描次数为50次～100次，二级谱扫描的一级谱母离子强度阈值为10cps～30cps。2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述蛋白质样本为无标记蛋白质样本；在进行所述质谱分析之前，还包括对所述蛋白质样本进行预处理，所述预处理包括步骤：将样本采用溶剂进行溶解处理，得到无标记蛋白质样本；及将所述无标记蛋白质样本进行肽段分级，得到预处理后样本。3.根据权利要求2所述的分析方法，其特征在于，所述肽段分级为高pH反相分级或质谱气相分级。4.根据权利要求3所述的分析方法，其特征在于，所述质谱气相分级分8级后进行色谱分离
‑
质谱分析，第一次质谱气相分级的扫描范围为400m/z～500m/z，第二次质谱气相分级的扫描范围为500m/z～600m/z，第三次质谱气相分级的扫描范围为600m/z～700m/z，第四次质谱气相...

【专利技术属性】
技术研发人员：张珅，雷姣，林戈，
申请(专利权)人：中信湘雅生殖与遗传专科医院有限公司，
类型：发明
国别省市：