RPGR基因突变检测引物组及其试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及基因诊断技术领域，尤其涉及RPGR基因突变检测引物组及其试剂盒。本发明专利技术提供了适宜的引物，并提供了其应用、试剂盒和检测方法，从而对在ORF15高度重复序列突变的位点能通过Sanger测序的方法进行检测，提高RPGR第15号外显子基因突变的检出率。第15号外显子基因突变的检出率。

【技术实现步骤摘要】
RPGR基因突变检测引物组及其试剂盒


[0001]本专利技术涉及基因诊断
，尤其涉及RPGR基因突变检测引物组及其试剂盒。

技术介绍

[0002]视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)是一组以感光细胞为主的在临床和遗传上具有异质性的视网膜退行性疾病，以夜盲、进行性视野受限和色素性视网膜病变为主要典型症状。RP的眼底检查特征包括骨针沉积、视网膜血管变细减少、视盘苍白、视野丧失以及异常、视网膜电图(electroretinography,ERG)反应减弱或无法记录。RP的遗传方式通常为常染色体显性遗传(约30％～40％)、常染色体隐性遗传(50％～60％)及X连锁遗传(5％～15％)，其中X连锁视网膜色素变性(X
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linked retinitis pigmentosa,XLRP)是这种疾病最严重的亚型。该亚型患者通常在生命的前20年内表现出夜盲和视野狭窄，到三四十岁时，在受影响的男性中进展为严重视力丧失或完全失明。到目前为止，研究人员已经确定了可导致XLRP的两个基因：RPGR(retinitis pigmentosa GTPase regulator,OMIM 312610)和RP2(retinitis pigmentosa 2,OMIM312600)。虽然XLRP被认为只在受累的男性成员中比较明显，但在一些女性携带者中也可以观察到与疾病相关的表型(一只眼或两只眼从无症状到严重的视网膜变性)。这使得基因诊断变得困难和复杂。
[0003]由RPGR基因突变引起的x连锁RP是最常见的隐性RP。其特征是儿童期杆状和锥状光感受器变性，导致视野缩小和早期严重的视力丧失。目前，还没有针对RPGR相关的RP的治疗方法，尽管在动物模型中有原理证明，但针对人类光感受器变性(RP)的基因治疗的效果直到现在还没有报道。RPGR基因有15个外显子，其中，第15号外显子共计2838bp；第15号外显子含有一个开放阅读框(exon open reading frame 15，ORF15)，大约60％的XLRP患者在ORF15存在突变。ORF15全长1.6kb，该区域富含GC，具有高度重复性。高通量测序对该区域很难捕获，覆盖度低，因此易造成假阴性结果。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供能够全部测通PGR第15号外显子的RPGR基因突变检测引物组及其试剂盒。
[0005]本专利技术提供的引物组，包括：引物对1～6中至少一种，其中：
[0006]引物对1包括如SEQ ID NO:1～2所示的2条引物，
[0007]引物对2包括如SEQ ID NO:3～5所示的3条引物，
[0008]引物对3包括如SEQ ID NO:6～8所示的3条引物，
[0009]引物对4包括如SEQ ID NO:9～10所示的2条引物，
[0010]引物对5包括如SEQ ID NO:11～15所示的5条引物，
[0011]引物对6包括如SEQ ID NO:16～17所示的2条引物。
[0012]具体的：
[0013]引物对1中，SEQ ID NO:1所示为上游引物，SEQ ID NO:2所示为下游引物，在样本
ID NO:1所示作为单引物进行测序。
[0059]预扩增的体系包括：PCRMix(2
×
)、样品DNA，上下游引物和纯水。
[0060]测序体系包括：预扩增产物、单引物、BigDye Reaction Mix(稀释18倍)。
[0061]对于区段2：
[0062]以SEQ ID NO:3所示为上游引物，SEQ ID NO:4所示为下游引物进行预扩增，以SEQ ID NO:5所示作为单引物进行测序。
[0063]预扩增的体系包括：GC buffer I、dNTP Mix、LA
‑
Taq聚合酶、样品DNA，上下游引物和纯水。
[0064]测序体系包括：预扩增产物、单引物、BigDye Reaction Mix(原液)和纯水。
[0065]对于区段3：
[0066]以SEQ ID NO:6所示为上游引物，SEQ ID NO:7所示为下游引物进行预扩增，以SEQ ID NO:8所示作为单引物进行测序。
[0067]预扩增的体系包括：GC buffer I、dNTP Mix、LA
‑
Taq聚合酶、样品DNA，上下游引物和纯水。
[0068]测序体系包括：预扩增产物、单引物、BigDye Reaction Mix(原液)和纯水。
[0069]对于区段4：
[0070]以SEQ ID NO:9所示为上游引物，SEQ ID NO:10所示为下游引物进行预扩增，以SEQ ID NO:9所示作为单引物进行测序。
[0071]预扩增的体系包括：PCRMix(2
×
)、样品DNA，上下游引物和纯水。
[0072]测序体系包括：预扩增产物、单引物、BigDye Reaction Mix(稀释18倍)。
[0073]对于区段5：
[0074]以SEQ ID NO:11所示为上游引物，SEQ ID NO:12所示为下游引物进行预扩增，以SEQ ID NO:13、14、15所示作为单引物分别进行三个测序反应。
[0075]预扩增的体系包括：PCRMix(2
×
)、样品DNA，上下游引物和纯水。
[0076]测序体系包括：预扩增产物、单引物、BigDye Reaction Mix(稀释18倍)。
[0077]对于区段6：
[0078]以SEQ ID NO:16所示为上游引物，SEQ ID NO:17所示为下游引物进行预扩增，以SEQ ID NO:16所示作为单引物进行测序。
[0079]预扩增的体系包括：PCRMix(2
×
)、样品DNA，上下游引物和纯水。
[0080]测序体系包括：预扩增产物、单引物、BigDye Reaction Mix(稀释18倍)。
[0081]下面结合实施例，进一步阐述本专利技术：
[0082]实施例1
[0083]1.基因目的序列查找：
[0084]根据NCBI及参考序列NM_001034853查找目的片段，查阅最新数据库显示RPGR15号外显子序列共计2838bp；ChrX:38287245
‑
38284408。我们将第15号外显子分为6段设计，共计3171bp，目的是将第15号外显子所有碱基全部覆盖(如图15)。
[0085]2.将RPGR第15号外显子共分6区，设计引物进行PCR扩增及一代Sanger测序：
[0086]区域1：共计473bp：
[0087]RPGR
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15
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F1:AGAGTCAACAGGGTATAGCTGA(SEQ ID本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.引物组，其特征在于，包括：引物对1～6中至少一种，其中：引物对1包括如SEQ ID NO:1～2所示的2条引物，引物对2包括如SEQ ID NO:3～5所示的3条引物，引物对3包括如SEQ ID NO:6～8所示的3条引物，引物对4包括如SEQ ID NO:9～10所示的2条引物，引物对5包括如SEQ ID NO:11～15所示的5条引物，引物对6包括如SEQ ID NO:16～17所示的2条引物。2.权利要求1所述的引物组在制备检测RPGR基因突变的试剂盒中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述RPGR基因突变包括如下至少一种：chrX:38285972、chrX:38286761:TTC>T、chrX:38286616:C>A、或chrX:382...

【专利技术属性】
技术研发人员：何伟，王卓实，李建康，于卉卉，王欣欣，孙赫男，吴迪，薛金会，王悦，王晓宇，刘晔，阴正勤，
申请(专利权)人：沈阳眼产业技术研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：