重组VEGFB的制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及重组VEGFB的制备方法与应用。本发明专利技术提供的重组VEGFB的制备方法主要包括重组VEGFB的纯化方法，包括包涵体溶解、亲和层析纯化、复性、凝胶过滤层析的步骤，纯化获得的重组VEGFB不仅具有良好的收率和纯度，并且具有良好的生理活性，对视网膜色素上皮细胞具有良好的保护作用。用。

【技术实现步骤摘要】
重组VEGFB的制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及重组VEGFB的制备方法与应用。

技术介绍

[0002]血管内皮生长因子B(VascularendothelialgrowthfactorB，VEGF
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B)是人血管内皮生长因子(Vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)成员之一。VEGF
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B基因位于11号染色体q13，基因全长为4000bp，包含8个外显子和6个内含子；VEGF
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B分为两种异构体，VEGF
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B167含有80％以上的转录信息，含有一个C末端结合域，使其能够隔离在细胞表面；另一个异构体VEGF
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B186还有一个疏水C末端，使其能够自由溶解。VEGF
‑
B含有VEGF家族标志序列PXCVXXX
‑
RCXGCC，并且与VEGF
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A有47％的氨基酸相同，但研究表明，VEGF
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B并不具有促进血管形成的特性。虽然VEGFB在血管生成中没有直接作用，但它与毛细血管直径和动脉大小的增加有关。此外，VEGFB在防止细胞死亡和促进适应性肥大方面有重要作用。最新研究表明VEGF
‑
B可上调多种抗氧化基因表达，能抑制在氧化应激作用导致的细胞死亡；VEGF
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B基因敲除小鼠的氧化相关基因上调及视网膜退行性病变。而加入VEGF
‑
B蛋白治疗，会使抗氧化基因表达上调，从而降低了视网膜细胞凋亡率。另外，VEGFB可以改善包括神经系统在内的各种组织的存活率，其作用主要体现在外周神经元上。
[0003]目前，对VEGFB的人工合成的研究较少，且有报道称以基因工程的方法制备的重组VEGFB多会以包涵体形式表达。总所周知，包涵体的纯化与复性步骤通常非常复杂。一些报道中，对VEGFB包涵体的春华采用亲和层析(ChelatingSepharoseFastFlow)，经复性后采用阳离子交换层析(SP
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Sepharose)，再经过透析后采用亲水层析(PolyhydroxymethylAhydrophiliccolumn)分离单倍体及二聚体。但该方法步骤较多，且工艺复杂，回收率和纯度皆不理想。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供重组VEGFB的制备方法与应用，该方法步骤简捷，能够实现重组VEGFB的快速回收，且回收率和纯度皆高。
[0005]本专利技术提供的试剂组合，包括包涵体溶解液、平衡液1、平衡液2、平衡液3、洗脱液和复性液；
[0006]所述包涵体溶解液包括水和Tris1.1～1.3mg/mL，NaH2PO4.2H2O15～16mg/mL，DTT3.0～3.2mg/mL和盐酸胍5.5～6.0g/L，pH值为8.3～8.7；
[0007]所述平衡液1包括水和Tris120～125mg/L，NaH2PO4.2H2O1.5～1.6g/L，盐酸胍57～58g/L，pH值为8.3～8.7；
[0008]所述平衡液2包括水和尿素350～370g/L，NaH2PO4.2H2O15～16g/L，Tris1.1～1.3g/L，pH值为6.3～6.7；
[0009]所述平衡液3包括水和尿素350～370g/L，NaH2PO4.2H2O15～16g/L，Tris1.1～1.3g/L，pH值为5.5～6.0；
[0010]所述洗脱液包括水和尿素350～370g/L，NaH2PO4.2H2O15～16g/L，Tris1.1～1.3g/L，咪唑33～35g/L，pH值为5.5～6.0；
[0011]所述复性液包括水和NaH2PO4.2H2O15～16g/L，Tris1.1～1.3g/L，DTT33～35g/L，pH值为5.5～6.0。
[0012]本专利技术实施例中，所述包涵体溶解液由水和如下组分组成：Tris1.21mg/mL，NaH2PO4.2H2O15.6mg/mL，DTT3.09mg/mL和盐酸胍5.731g/L，pH值为8.5；
[0013]所述平衡液1由水和如下组分组成：Tris121mg/L，NaH2PO4.2H2O1.56g/L，盐酸胍57.31g/L，pH值为8.5；
[0014]所述平衡液2由水和如下组分组成：尿素360.36g/L，NaH2PO4.2H2O15.601g/L，Tris1.211g/L，pH值为6.5；
[0015]所述平衡液3由水和如下组分组成：尿素360.36g/L，NaH2PO4.2H2O15.601g/L，Tris1.211g/L，pH值为5.8；
[0016]所述洗脱液由水和如下组分组成：尿素360.36g/L，NaH2PO4.2H2O15.601g/L，Tris1.211g/L，咪唑34.04g/L，pH值为5.8；
[0017]所述复性液由水和如下组分组成：NaH2PO4.2H2O15.601g/L，Tris1.211g/L，DTT34.04g/L，pH值为5.8。
[0018]本专利技术所述的试剂组合在重组VEGFB纯化中的应用。
[0019]本专利技术还提供了一种重组VEGFB的纯化方法，其以所述的试剂组合进行纯化，包括如下步骤：
[0020]步骤1：将重组VEGFB的包涵体以所述包涵体溶解液溶解，离心后取上清液；
[0021]步骤2：以平衡液1平衡Ni
2+
柱，然后将上清液上样，依次以所述平衡液2和所述平衡液3冲洗后，以洗脱液洗脱，收集洗脱峰；
[0022]步骤3：将洗脱峰以所述复性液进行复性，离心后收集上清液，；
[0023]步骤4：用所述平衡液3平衡凝胶层析柱，然后将步骤3所述上清液上样于层析柱，收集目标蛋白峰，即为含有重组VEGFB的溶液。
[0024]步骤1中，
[0025]所述包涵体与包涵体溶液的质量
‑
体积比为1g：10mL；
[0026]所述离心的条件为4℃，10000rpm离心20min。
[0027]步骤2中：
[0028]所述Ni
2+
柱为固定有Ni
2+
的chelatingSepharoseFastFlow柱；
[0029]所述平衡液1的体积为3～5倍柱体积，流速为5～50mL/min；
[0030]所述上样的流速为5～50mL/min；
[0031]所述平衡液2的体积为3～5倍柱体积，流速为5～50mL/min；
[0032]所述平衡液3的体积为3～5倍柱体积，流速为5～50mL/min；
[0033]所述洗脱液的流速为5～50mL/min。
[0034]步骤3中：
[0035]所述洗脱峰与复性液的体积比为1:3；
[0036]所述复性条件为4℃放置8～12h；<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.试剂组合，其特征在于，包括包涵体溶解液、平衡液1、平衡液2、平衡液3、洗脱液和复性液；所述包涵体溶解液包括水和Tris 1.1～1.3mg/mL，NaH2PO4.2H2O 15～16mg/mL，DTT 3.0～3.2mg/mL和盐酸胍5.5～6.0g/L，pH值为8.3～8.7；所述平衡液1包括水和Tris 120～125mg/L，NaH2PO4.2H2O 1.5～1.6g/L，盐酸胍57～58g/L，pH值为8.3～8.7；所述平衡液2包括水和尿素350～370g/L，NaH2PO4.2H2O 15～16g/L，Tris 1.1～1.3g/L，pH值为6.3～6.7；所述平衡液3包括水和尿素350～370g/L，NaH2PO4.2H2O 15～16g/L，Tris 1.1～1.3g/L，pH值为5.5～6.0；所述洗脱液包括水和尿素350～370g/L，NaH2PO4.2H2O 15～16g/L，Tris 1.1～1.3g/L，咪唑33～35g/L，pH值为5.5～6.0；所述复性液包括水和NaH2PO4.2H2O 15～16g/L，Tris 1.1～1.3g/L，DTT 33～35g/L，pH值为5.5～6.0。2.根据权利要求1所述的试剂组合，其特征在于，所述包涵体溶解液由水和如下组分组成：Tris 1.21mg/mL，NaH2PO4.2H2O 15.6mg/mL，DTT 3.09mg/mL和盐酸胍5.731g/L，pH值为8.5；所述平衡液1由水和如下组分组成：Tris 121mg/L，NaH2PO4.2H2O 1.56g/L，盐酸胍57.31g/L，pH值为8.5；所述平衡液2由水和如下组分组成：尿素360.36g/L，NaH2PO4.2H2O 15.601g/L，Tris 1.211g/L，pH值为6.5；所述平衡液3由水和如下组分组成：尿素360.36g/L，NaH2PO4.2H2O 15.601g/L，Tris 1.211g/L，pH值为5.8；所述洗脱液由水和如下组分组成：尿素360.36g/L，NaH2PO4.2H2O 15.601g/L，Tris 1.211g/L，咪唑34.04g/L，pH值为5.8；所述复性液由水和如下组分组成：NaH2PO4.2H2O 15.601g/L，Tris 1.211g/L，DTT 34.04g/L，pH值为5.8。3.一种重组VEGFB的纯化方法，其特征在于，以权利要求1或2所述的试剂组合进行纯化，包括如下步骤：步骤1：将重组VEGFB的包涵体以所述包涵体溶解液溶解，离心后取上清液；步骤2：以平衡液1平衡Ni
2+
柱，然后将上清液上样，依次以所述平衡液2和所述平衡液3冲洗后，以洗脱液洗脱，收集洗脱峰；步骤3：将洗脱峰以所述复性液进行复性，离心后收集上清液，；步骤4：用所述平衡液3平衡凝胶层析柱，然后将步骤3所述上清液上样于层析柱...

【专利技术属性】
技术研发人员：张朔，李雪娇，冯铃，刘辉，赵航，吴骁，康慧颖，张鹏，赵洪礼，何伟，
申请(专利权)人：沈阳眼产业技术研究院有限公司辽宁何氏医学院，
类型：发明
国别省市：