一种氢化可的松转化泼尼松龙的方法技术

本发明专利技术提出了一种氢化可的松转化泼尼松龙的合成方法，包括以下步骤：S1，构建重组质粒pET

【技术实现步骤摘要】
一种氢化可的松转化泼尼松龙的方法


[0001]本专利技术涉及生物化工
，尤其涉及一种氢化可的松转化泼尼松龙的方法。

技术介绍

[0002]类固醇具有重要的生理功能和广泛的临床应用，目前它们是仅次于抗生素的第二大类药物。在类固醇药物中，许多药物在1,2位上含有双键，它们通常具有更强的效力，并能减少药物引起的盐分滞留。例如，泼尼松龙的抗炎能力是氢化可地松的四倍，是可的松的五倍。因此，对类固醇化合物进行Δ1
‑
脱氢是类固醇研究中的一个重要方向。这种转化可以通过化学或生物催化的方法实现。由于类固醇分子的复杂性，化学方法需要一系列复杂的反应步骤。例如通过TBDMSCl将DDQ(二氯二氰基苯醌)与Δ4
‑
3酮类固醇进行Δ1
‑
脱氢反应，整个反应需要7步。这些化学方法的生产工艺比较复杂，能耗高，对环境的污染严重。而生物催化类固醇的Δ1
‑
脱氢通常在温和的条件下进行，具有很高的区域选择性，因此生产步骤简单，产生的污染物较少，对环境更加友好，满足可持续性发展的要求。
[0003]目前也有一些文献报道过3
‑
酮基甾体
‑
Δ1
‑
脱氢酶的融合表达与纯化，但是他们构建出的质粒pET
‑
ksdD在大肠杆菌中经过IPTG诱导后产生的酶为不具备生物学功能的包涵体，要获得具有一定生物学功能的酶，还需要进行变性与复性以后才能够正常的使用，且复性后的酶对底物的转化率较低，只能达到15.6％。/>[0004]公开号为CN101397324A、CN1361108A、CN105384790A的专利均公开了多步化学合成制备泼尼松龙的方法，但上述专利普遍路线较多、工艺繁杂以及生产周期较长，收率普遍较差，这些也增加了泼尼松龙的生产成本。
[0005]关于生物催化类固醇的方法中，公开号为CN107058444A的专利公开了一种生物酶法制备泼尼松龙的方法，克服了工艺复杂、耗时长和转化率低等技术问题，该方法虽说也是一步法制备泼尼松龙，但是在制备过程中除了酶以外还需要其他几种试剂来参与反应，大大增加了生产的成本。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术提出了一种氢化可的松转化泼尼松龙的方法，解决了现有技术中转化率低、收率不理想以及合成步骤复杂等技术问题。
[0007]本专利技术的技术方案是这样实现的：
[0008]本专利技术提供了一种氢化可的松转化泼尼松龙的方法，包括如下步骤：
[0009]S1，构建含有KstD基因的重组质粒pET
‑
21a(+)
‑
KstD；
[0010]S2，取含有步骤S1所述重组质粒pET
‑
21a(+)
‑
KstD的细胞，转接于培养基，加入IPTG培养，诱导目的蛋白表达，再加入缓冲溶液重悬菌体，超声破碎细胞，离心、纯化；
[0011]S3，将氢化可的松乳化处理，溶于缓冲溶液，加入PMS和步骤S2纯化得到的pET
‑
21a(+)
‑
KstD催化酶，于25
‑
30℃反应12
‑
16h，即得到泼尼松龙。
[0012][0013]通过PCR扩增出KstD酶的相关基因，其引物的序列为：F:5
‘
AATGGGTCGCGGATCCGTAGATCAGATGAATAATATTACCGTTATGGATC 3
’
，R:5
‘
GACGGAGCTCGAATTTGTATGACCTGCGGTTGCATG3
’
。
[0014]通过PCR扩增使载体pET
‑
21a(+)线性化，使用的引物为：F:5
‘
AATTCGAGCTCCGTCGACAAG3
’
，R:5
‘
GATCCGCGACCCATTTGCT 3
’
。
[0015]进一步优选地，S1具体包括如下步骤：
[0016]S1，PCR扩增KstD基因，根据引物序列使载体pET
‑
21a(+)线性化，将KstD基因与线性化后的PCR产物混合，加入DNA连接酶，于45
‑
50℃反应10
‑
15min，通过无缝克隆连接，构建得到重组质粒pET
‑
21a(+)
‑
KstD。
[0017]进一步优选地，S2具体包括如下步骤：
[0018]S2，取含有步骤S1所述重组质粒pET
‑
21a(+)
‑
KstD的细胞，转接于含AMP抗性的LB培养基，于35
‑
37℃培养菌液，加入IPTG后于20
‑
25℃培养15
‑
18h，再加入缓冲溶液重悬菌体，超声破碎细胞，离心、纯化。
[0019]进一步优选地，所述pET
‑
21a(+)
‑
KstD催化酶具有如SEQ ID NO.1所示的序列结构，所述SEQ ID NO.1为核苷酸序列，序列结构见序列表。
[0020]进一步优选地，所述pET
‑
21a(+)
‑
KstD催化酶具有如SEQ ID NO.2所示的序列结构，所述SEQ ID NO.2为氨基酸序列，序列结构见序列表。
[0021]进一步优选地，步骤S2、S3所述缓冲溶液为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液，pH值为7
‑
9，浓度为0.05
‑
0.1mol/L。
[0022]进一步优选地，步骤S1中KstD基因、PCR产物和DNA连接酶的体积比为(0.5
‑
0.6)：1：(9
‑
10)。
[0023]进一步优选地，步骤S2培养菌液至OD
600
值为0.6
‑
0.8。
[0024]进一步优选地，步骤S2中IPTG浓度为1.8
‑
2mM/L。
[0025]进一步优选地，步骤S3中氢化可的松、pET
‑
21a(+)
‑
KstD催化酶和PMS的质量比为1：(0.001
‑
0.002)：(0.01
‑
0.02)。
[0026]本专利技术的氢化可的松转化泼尼松龙的方法，相对于现有技术，具有以下有益效果：
[0027](1)本专利技术通过正确构建重组质粒pET
‑
21a(+)
‑
KstD，提高KstD催化酶的活性，再利用大肠杆菌BL21作为工业菌株，能将氢化可的松高效的转化成泼尼松龙，10吨的酶转体系下转化率可达97％，收率高；
[0028](2)本专利技术合成方法所需试剂少，工艺简单，设备要求低，不本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种氢化可的松转化泼尼松龙的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1，构建含有KstD基因的重组质粒pET
‑
21a(+)
‑
KstD；S2，取含有步骤S1所述重组质粒pET
‑
21a(+)
‑
KstD的细胞，转接于培养基，加入IPTG培养，诱导目的蛋白表达，再加入缓冲溶液重悬菌体，超声破碎细胞，离心、纯化；S3，将氢化可的松乳化处理，溶于缓冲溶液，加入PMS和步骤S2纯化得到的pET
‑
21a(+)
‑
KstD催化酶，于25
‑
30℃反应12
‑
16h，即得到泼尼松龙。2.如权利要求1所述的一种氢化可的松转化泼尼松龙的方法，其特征在于，S1具体包括如下步骤：S1，PCR扩增KstD基因，根据引物序列使载体pET
‑
21a(+)线性化，将KstD基因与线性化后的PCR产物混合，加入DNA连接酶，于45
‑
50℃反应10
‑
15min，通过无缝克隆连接，构建得到重组质粒pET
‑
21a(+)
‑
KstD。3.如权利要求1所述的一种氢化可的松转化泼尼松龙的方法，其特征在于，S2具体包括如下步骤：S2，取含有步骤S1所述重组质粒pET
‑
21a(+)
‑
KstD的细胞，转接于含AMP抗性的LB培养基，于35
‑
37℃培养菌液，加入IPTG后于20
‑
25℃培养15
‑
18h，...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏海，系祖斌，李明磊，陶琳，姚立成，
申请(专利权)人：湖北共同甾体药物研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：